一种治疗COVID-19的基因改造干细胞制造技术

一种治疗COVID

【技术实现步骤摘要】
一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞


[0001]本专利技术涉及一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，属于生物医学领域的传染病防治技 术。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS
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CoV
‑
2的主要结构 包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。 其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1
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NTD)和受体结合域(S1
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RBD)组成，S1
‑
RBD负责识别并结合宿主细胞表面 受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进 入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用， 同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
[0003]目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到 损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞 因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NFr/>‑
κB等信号通路来治 疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有 非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎 治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以功能改造的干细胞治疗 COVID的文献报道。
[0004]通常间充质干细胞在体外传代至15
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30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗 原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表 型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。 这为干细胞体外培养寿命的改良和产业扩增提供了依据。文献报道，SARS
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CoV能在ACE2转 染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS
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CoV
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2也通过 ACE2受体感染宿主细胞。在传统观念上，通常不希望SARS
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CoV
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2通过ACE2受体感染机体细 胞和治疗用干细胞，本专利技术却以相反的方法，构建表达ACE2的重组载体，转染干细胞，以增 强干细胞表达ACE2功能，从而增强干细胞对SARS
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CoV
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2的易感性，使干细胞在治疗中与宿 主细胞竞争吸入较多的新冠病毒，以减少机体正常组织感染机会，然后通过人工装配在干细 胞DNA的RNA干扰基因抑制、杀灭被ACE2吸引入干细胞内的新冠病毒。
[0005]RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主 细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶 (Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞 内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解 旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与 外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂
mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源 单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成 的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进 一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见以人工构建的具有RNA干扰功能的干细胞 为载体制备新冠病毒疫苗的报道。

技术实现思路

[0006]基于目前治疗用干细胞的上述问题，本专利技术人提出了本专利技术。
[0007]本专利技术的目的是制备一种人工装配永生化基因、新冠病毒易感基因和RNA干扰基因的基 因改造干细胞。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0009]首先，获得间充质干细胞。例如，从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中获得间充 质干细胞和/或羊水成纤维细胞，筛选或诱导成肺干细胞。
[0010]进而，给干细胞装配永生化基因。例如，构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转 染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，从而获得能永久生存、无限传代 的新功能，可再经鉴定或诱导获得肺干细胞系。
[0011]进而，给干细胞装配新冠病毒易感基因。例如，将血管紧张素转换酶II(ACE2)基因连 接到慢病毒表达载体pHBLV
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CMV
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ACE2
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EF1
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ZsGreen
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T2A
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puro或pGC
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FU中，分别构建重组质 粒pHBLV
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OE
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ACE2或pGC
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FU
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ACE2，将重组质粒pHBLV
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OE
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ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G) 或将重组质粒pGC
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FU
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ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞， 包装携带ACE2的重组慢病毒OE
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ACE2或FU
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ACE2，将重组慢病毒转染干细胞，使ACE2基因 整合到干细胞DNA上。从而增强干细胞的病毒亲嗜性，即更易与宿主细胞竞争吸入nCoV并在 干细胞内进行RNA干扰、杀灭nCoV。
[0012]进而，给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因。例如，设计和优选新冠病毒(nCoV)的靶 向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒 pHBLV
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nCoV
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N
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shRNA或LV3
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nCoV
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N
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shRNA，将重组质粒pHBLV
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nCoV
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N
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shRNA和包装质粒 (pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，将新冠病毒的易感基因ACE2插入已被SV40LT和/或hTERT转染的永生化干细胞DNA中，制备易被新冠病毒感染的易感干细胞，进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入所制易感干细胞DNA中，构建既能通过ACE2将新冠病毒吸入干细胞内又能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制并能在体外无限传代扩增的基因改造干细胞。2.根据权利要求1所述的一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、肺干细胞或诱导肺干细胞。3.根据权利要求1所述的一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，所述插入基因包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、干细胞的慢病毒转染、基因改造干细胞的筛选和鉴定。4.根据权利要求1、3所述的一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和/或将新冠病毒易感基因ACE2克隆到慢病毒载体的多克隆位点。5.根据权利要求1所述的一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。6.根据权利要求1所述的一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV
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F：5
’‑
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
‑
3；下游引物为：EF1
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Rn：5
’‑
GCCAGTACACGACATCACTT
‑3’
；β
‑
actin的上游和下游引物分别为：5
’‑
TGGACTTCGAGCAAGAGATGG
‑3’
、5
’‑
ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG
‑3’
。7.权利要求1所述的一种治疗COVID
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19的基因改造干细胞，其特征在于，按以下步骤制备：(1)获得间充质干细胞：从干细胞样本库、产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐带血细胞、脐带组织或胎盘组织细胞中分离、诱导羊水成纤维细胞、间充质干细胞或肺干细胞。(2)给干细胞装配永生化基因：构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：