一种维持体外培养CHODG44细胞后期活率的培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于CHO细胞培养的无血清培养基及应用，尤其适合CHO DG44细胞大规模悬浮培养。所述无血清培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、添加物组分，所述添加物为乙醇胺、D

【技术实现步骤摘要】
一种维持体外培养CHO DG44细胞后期活率的培养基及其应用
[0001]

[0002]本专利技术涉及细胞培养领域，更特别地，涉及一种用于培养CHO DG44细胞的无血清培养基及其应用，所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模悬浮培养，细胞不易结团，维持体外培养CHO DG44细胞后期活率，目标蛋白表达量高。
[0003]
技术介绍

[0004]过去几十年中，哺乳动物细胞培养技术取得了较大成就。已上市的治疗性生物技术药物，用哺乳动物细胞生产的占 50%以上，其中，尤以中华仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞的使用最为广泛。基于大规模生物反应器的哺乳动物细胞（特别是 CHO 细胞）培养技术已逐渐成为生产单抗药物的核心技术。CHO细胞能够生产高质量的生物制剂，其与人相似的翻译后修饰水平能够达到克级。此外，相较于其他细胞类型，CHO细胞具有（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，（2）在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，（3）能够表达与人相似的翻译后修饰等优点。因此，CHO细胞成为当前重组蛋白工业化生产的主要宿主细胞。CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。目前，有两种主要的CHO表达系统被广泛应用，基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）选择体系和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸硫氧胺（MSX）选择体系。
[0005]相对于动物细胞贴壁培养而言，单个细胞悬浮培养具有细胞生长均一性好、传质效率高、容易实现规模放大和过程控制的特点。哺乳动物细胞的悬浮培养己成为目前动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择，超过80%的哺乳动物细胞表达生物技术药物采用动物细胞悬浮培养为其生产工艺。对于CHO细胞悬浮培养而言，要在规模化的培养中获取好的培养结果，设计出适宜细胞悬浮生长的培养基是至关重要的。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便;使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发适用于CHO细胞大规模培养的无血清培养基。
[0006]在无血清培养基中悬浮培养CHO细胞时，常常发生结团现象，降低了细胞的活性，蛋白表达受到影响，但迄今细胞结团的原因还不甚清楚。有研究认为结团可能是由于DNA从死亡的细胞间释放后，在细胞与细胞之间架桥引起的，若在培养基中添加脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）可以避免结团现象发生。但是Dee等则认为通过添加肝素、硫酸葡聚糖、硫酸戊糖等高度磺化硫酸聚阴离子物质，可成功地解决BTI-TN5B1-4昆虫细胞的结团问题，使蛋白表达量提高了倍2-4。有专利文献（CN101724600A，公开日期20100609）公开了一种支持CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其中使用了嵌段式聚醚F-68 (Pluronic F-68) :
300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸 5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25。
[0013]在一个优选实施方案中，所述维生素组分为：单位为mg/L，维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0.2-2；叶酸 1-10；肌醇 2-20；烟酰胺 0.1-1；吡哆醇（维生素B6） 0.1-2.5；核黄素 0.02-1；硫胺素（维生素B1） 0.1-5；维生素B12 0.05-2；硫酸葡聚糖 5-250。
[0014]在一个优选实施方案中，所述无机盐组分为：单位为mg/L，氯化钙 5-50；硝酸铁0.25-1.5；氯化钾 10-100；氯化镁 25-150；硫酸镁 5-25；氯化锰 0.00001-0.005；氯化钠 3000-5000；碳酸氢钠 100-2000；磷酸氢二钠 10-750；亚硒酸钠 0.0000005-0.0002；矾酸铵 0.00005-0.002；硫酸锌 0.001-0.15。
[0015]在一个优选实施方案中，所述CHO无血清培养基由如下组分组成：各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：乙醇胺 0.5-4；D-葡萄糖 2500-6000；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）500-2000；胰岛素 2-5；亚油酸 0.01-3；硫辛酸 0.2-10；苯酚红 0.5-10；腐胺 0.01-1；N乙酰半胱氨酸：10-500；丙酮酸钠 10-200；转铁蛋白 5-7；IGF-1 10-20；AEO-9 100-200；丙氨酸 10-100；精氨酸 200-400；天冬酰胺 5-100；天冬氨酸 10-300；半胱氨酸 15-100；谷氨酸 5-50；谷氨酰胺 300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸 5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25。
[0016]维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0.2-2；叶酸 1-10；肌醇 2-20；烟酰胺 0.1-1；吡哆醇（维生素B6） 0.1-2.5；核黄素 0.02-1；硫胺素（维生素B1） 0.1-5；维生素B12 0.05-2；硫酸葡聚糖 5-250。
[0017]氯化钙 5-50；硝酸铁0.25-1.5；氯化钾 10-100；氯化镁 25-150；硫酸镁 5-25；氯化锰 0.00001-0.005；氯化钠 3000-5000；碳酸氢钠 100-2000；磷酸氢二钠 10-750；亚硒酸钠 0.0000005-0.0002；矾酸铵 0.00005-0.002；硫酸锌 0.001-0.15。
[0018]在一个优选实施方案中，所述CHO无血清培养基由如下组分组成：各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：乙醇胺 1；
D-葡萄糖 4000；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）1000；胰岛素 3；亚油酸 1；硫辛酸 5；苯酚红 2.5；腐胺 0.1；N乙酰半胱氨酸：100；丙酮酸钠 50；转铁蛋白 6；IGF-1 15；AEO-9 150；丙氨酸 50；精氨酸 300；天冬酰胺 50；天冬氨酸 100；半胱氨酸 75；谷氨酸 30；谷氨酰胺 400；甘氨酸 25；组氨酸 35；异亮氨酸 75；亮氨酸 120；赖氨酸 150；蛋氨酸 40；苯丙氨酸 56；脯氨酸 10；丝氨酸 27；苏氨酸 80；色氨酸 25；酪氨酸 65；缬氨酸 85；牛磺酸 10；维生素H 0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养CHO细胞的无血清培养基，其特征在于，包含氨基酸、维生素、无机盐、添加物组分，各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：乙醇胺 0.5-4；D-葡萄糖 2500-6000；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）500-2000；胰岛素 2-5；亚油酸 0.01-3；硫辛酸 0.2-10；苯酚红 0.5-10；腐胺 0.01-1；N乙酰半胱氨酸：10-500；丙酮酸钠 10-200；转铁蛋白 5-7；IGF-1 10-20；AEO-9 100-200。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述氨基酸组分为：单位为mg/L，丙氨酸 10-100；精氨酸 200-400；天冬酰胺 5-100；天冬氨酸 10-300；半胱氨酸 15-100；谷氨酸 5-50；谷氨酰胺 300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸 5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25。3.根据权利要求1-2任一项所述的培养基，其特征在于，所述维生素组分为：单位为mg/L，维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0.2-2；叶酸 1-10；肌醇 2-20；烟酰胺 0.1-1；吡哆醇（维生素B6） 0.1-2.5；核黄素 0.02-1；硫胺素（维生素B1） 0.1-5；维生素B12 0.05-2；硫酸葡聚糖 5-250。4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，所述无机盐组分为：单位为mg/L，氯化钙 5-50；硝酸铁0.25-1.5；氯化钾 10-100；氯化镁 25-150；硫酸镁 5-25；氯化锰 0.00001-0.005；氯化钠 3000-5000；碳酸氢钠 100-2000；磷酸氢二钠 10-750；亚硒酸钠 0.0000005-0.0002；矾酸铵 0.00005-0.002；硫酸锌 0.001-0.15。5.根据权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：乙醇胺 0.5-4；D-葡萄糖 2500-6000；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）500-2000；胰岛素 2-5；亚油酸 0.01-3；硫辛酸 0.2-10；苯酚红 0.5-10；腐胺 0.01-1；N乙酰半胱氨酸：10-500；
丙酮酸钠 10-200；转铁蛋白 5-7；IGF-1 10-20；AEO-9 100-200；丙氨酸 10-100；精氨酸 200-400；天冬酰胺 5-100；天冬氨酸 10-300；半胱氨酸 15-100；谷氨酸 5-50；谷氨酰胺 300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸 5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25；维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖志华，王晓光，曾娇，
申请(专利权)人：上海奥浦迈生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：