一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法技术

一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维干细胞，以SV40LT和/或hTERT转染的方法构建永生羊水干细胞系，筛选出永生肺干细胞系，然后将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入永生肺干细胞系DNA，制备通过shRNA靶向干扰新冠病毒在肺干细胞内复制并能在体外产业化扩增的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞。因沉默永生肺干细胞。因沉默永生肺干细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS
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CoV
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2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1
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NTD)和受体结合域(S1
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RBD)组成，S1
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RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
[0003]目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF
‑
κB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以进一步改造的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞治疗COVID
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19的文献报道。
[0004]通常间充质干细胞在体外传代至15
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30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为干细胞体外培养寿命的改良和产业扩增提供了依据，但尚未见对干细胞进行永生化功能改造以用于治疗COVID
‑
19的文献报道。
[0005]RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶 (Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见对干细胞进行新冠病毒RNA干扰功能改造以用于治疗COVID
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19的文献报道。

技术实现思路

[0006]基于目前治疗用干细胞的问题，本专利技术人提出了本专利技术。
[0007]本专利技术的目的是提供一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0009]首选，分离羊水成纤维细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维细胞，或从新生儿脐带血、脐带组织或胎盘组织中分离间充质干细胞。
[0010]进而，构建永生化羊水细胞系：构建hTERT和/或SV40LT重组载体，转染羊水成纤维细胞或间充质干细胞，制备能无限传代、永久生存的永生化羊水细胞系或间充质干细胞系。
[0011]进而，筛选永生化干细胞系：用流式细胞仪检测来自不同克隆细胞系的表面分子，包括阳性分子CD73
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APC、CD90
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FITC、CD44
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PE、CD105
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Cy5.5和阴性分子CD11b
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PE、CD19
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PE、 CD34
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PE、CD45
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PE、HLA
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DR
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PE。
[0012]进而，筛选永生肺干细胞系：需符合以下特征
①
呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状；
②
细胞表面标志物CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和 CD44为阳性；
③
角蛋白表达呈阴性，c
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Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性；
④
vimentin、 collagen III、fibronectin表达呈阳性，而pro
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Surfactant protein C、von Willebrandfactor及α
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smooth muscle actin表达呈阴性。
[0013]进而，给永生肺干细胞系装配RNA干扰基因：优选靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV
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nCoV
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shRNA或LV3
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nCoV
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shRNA，将重组质粒pHBLV
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nCoV
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shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或将重组质粒LV3
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nCoV
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shRNA和包装质粒(pLV/helper
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SL3、pLV/helper
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SL4和pLV/helper
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SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染肺干细胞系，使shRNA基因整合到肺干细胞DNA上，从而获得能干扰nCoV在肺干细胞内复制的新功能。
[0014]进而，制成一种人工装配永生化基因、新冠病毒RNA干扰基因的肺干细胞系。
[0015]本专利技术的有益效果在于：
[0016]将原本弃用的组织细胞改造为兼具干细胞治疗功能、永生化功能、新冠病毒RNA干扰功能的肺干细胞系，可用于替换传统的腺病毒载体，制备新冠病毒永生干细胞载体疫苗。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维干细胞，以SV40LT和/或hTERT基因转染的方法构建永生化羊水干细胞系，筛选永生肺干细胞系，然后将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入永生肺干细胞系DNA，制备能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在所述肺干细胞内复制并能在体外产业化扩增的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞。2.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述肺干细胞从产前诊断后剩余的胎儿细胞、胚胎间充质干细胞、成体间充质干细胞中筛选，或经干细胞诱导获得肺干细胞。3.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述shRNA插入永生肺干细胞包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒包装、慢病毒转染、肺干细胞系的筛选和鉴定。4.根据权利要求1、3所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA克隆到慢病毒载体的多克隆位点。5.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。6.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：(1)分离羊水成纤维细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维细胞，或从新生儿脐带血、脐带组织或胎盘组织中分离间充质干细胞。(2)构建永生羊水细胞系：构建hTERT和/或SV40LT重组载体，转染羊水成纤维细胞或间充质干细胞，制备能无限传代、永久生存的永生化羊水细胞系或间充质干细胞系。(3)筛选永生干细胞系：用流式细胞仪检测来自不同克隆细胞系的表面分子，包括阳性分子CD73
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APC、CD90
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FITC、CD44
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PE、CD105
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Cy5.5和阴性分子CD11b
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PE、CD19
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【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：