一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过提取DNA、构建载体和重组菌株这三个步骤来实现纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌的共表达。本发明专利技术克隆了牛瘤胃微生物的的纤维二糖水解酶基因cbh与内切‑β‑1,4‑葡聚糖酶基因，将其连同乳酸菌信号肽usp45一同克隆至表达载体pMG36e中获得分泌型表达载体pMG36e::eg::cbh，使用DNS法测定总酶活，外切酶酶活以及内切酶酶活发现，滤纸酶活为7.2956±1.5241U/mL，重组菌液上清沉淀蛋白的外切酶酶活为13.0266±0.2514U/mL，内切酶酶活为14.7655±0.1017U/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用。
技术介绍
纤维素酶是一类将纤维素降解为单糖的一种复合酶系，主要作用于纤维素的β-D-1-4葡萄糖苷键，将纤维素降解为纤维二糖、葡萄糖等物质，根据其作用部位的差别，主要包括：1)内切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)，即内切1,4-β-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)，也称为Cx酶；2)外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase，CBH)，即外切β-1,4-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶(exo-B-1,4-D-glucanase，EC3.2.1.91)；3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)，即β-D-葡葡糖苷酶(β-D-glucosidase，EC3.2.1.21)。正是通过这3种酶的共同配合，将纤维素物质降解为单糖等，它们缺一不可。内切葡聚糖酶，主要对纤维素的β-D-1,4葡萄糖苷键发挥作用，使β-D-1,4葡萄糖苷键断裂，产生大量短链纤维素分子及寡糖，还有一些纤维素分子带非还原性末端。外切β-1,4葡聚糖酶主要作用于内切葡聚糖酶水解产物带非还原性末端的纤维素小分子和还原性末端，通过水解纤维素的β-D-1,4葡萄糖苷键，产生纤维二糖分子。这种二糖和其它纤维寡糖的进一步水解由β葡萄糖苷酶作用降解为葡萄糖。秸秆青贮使青贮料得以长期保存，还可增加饲料的适口性，并且基本不影响饲料的纤维素，维生素和蛋白质等的含量。但植物秸秆细胞壁含有40％～50％纤维素，在青贮过程中含量基本不变，需经过纤维素酶的作用水解成单糖才有利于动物吸收利用，同时破坏了植物的细胞壁还可以释放出原生质中的营养成分，增加饲料的利用率和动物的生产性能。研究也发现纤维素酶添加到饲料可补充草食动物内源酶的不足，有消除抗营养因子的作用，可以提高畜禽生产性能，降低致病微生物的黏附和定植等功能。因此，通过基因工程的方法将纤维素酶基因共表达载体导入乳酸菌中构建分泌型表达菌株，乳酸菌分泌型表达载体的成功构建可实现外源基因的分泌表达，因此不需再进行酶制剂的发酵生产、纯化和添加过程即可直接加入青贮原料中进行青贮，并在青贮的同时不断的分泌纤维素酶，降解秸秆中的纤维素，产生的单糖又能被乳酸菌所利用，促进青贮，从而可提高青贮饲料品质、营养价值和消化率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高青贮饲料中纤维素利用率，提高青贮饲料品质、营养价值和消化率的牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，包括如下步骤：1)提取牛瘤胃混合微生物总DNA；2)以总DNA为模板扩增得到cbh基因与eg基因片段，将其与乳酸菌信号肽usp45一同整合至表达载体pMG36e中，构建出分泌型表达载体pMG36e::eg::cbh；3)将测序正确后的重组质粒电转导入乳酸如球菌L.lactisNZ9000，得pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000重组菌株。进一步地，所述牛瘤胃微生物纤维素酶基因由烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因与多粘类芽孢杆菌杆菌内切-β-1,4-葡聚糖酶基因共同组成。进一步地，所述乳酸菌受体菌为乳酸乳球菌L.lactisNZ9000。所述的一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，采用以下方式实现：1)将烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因与多粘类芽孢杆菌杆菌eg基因进行重组，得重组乳酸菌菌株；2)分别以滤纸、再生无定型纤维素与CMC-Na为底物，使用DNS法测定总酶活，外切酶酶活以及内切酶酶活；3)以重组菌液上清为粗酶测定重组酶的底物特异性，最适pH与温度，以及金属离子与化学试剂对酶活的影响。进一步地，所述步骤1)中重组乳酸菌菌株将重组纤维素酶分泌到胞外，在48-65kDa之间有两个条带。进一步地，所述步骤2)中滤纸酶活为7.2956±1.5241U/mL，重组菌液上清沉淀蛋白的外切酶酶活为13.0266±0.2514U/mL，内切酶酶活为14.7655±0.1017U/mL。进一步地，所述步骤3)中底物特异性大小顺序为微晶纤维素>再生无定型纤维素>CMC-Na>脱脂棉>滤纸。进一步地，所述步骤3)中最适pH与温度分别为pH＝6与80℃。所述烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因，GeneBank编号为XM_745951.1，多粘类芽孢杆菌杆菌eg基因，GeneBank编号AB_695293.1。1mM的Fe2+、Ba2+对重组乳酸菌纤维素酶有促进作用；而1mM的Mn2+、Cu2+几乎对酶活无影响；同时1mM的Zn2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+、Co2+、K+、Mg2+、EDTA以及1％的吐温20对酶活有抑制作用。5mM的Mn2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Mg2+以及10％的吐温20对酶活有促进作用；5mM的Zn2+、Hg2+、K+、EDTA对酶活有抑制作用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1)本专利技术根据NCBI下载的纤维素酶cbh基因与eg基因序列，设计多对引物，以牛瘤胃的全基因组为模板分别扩增出两条大小为1500bp左右的目的条带；将其连同乳酸菌信号肽usp45一同克隆至表达载体pMG36e中获得分泌型表达载体pMG36e::eg::cbh；分别用SacⅠ和XbaⅠ，XbaⅠ和PstⅠ内切酶双酶切重组质粒，同时使用SacⅠ单酶切重组质粒与pMG36e空质粒加以验证，重组质粒切出两条大小约为1500bp的条带，并将该质粒送至金唯智公司测序后，结果表明该pMG36e::eg::cbh重组质粒构建成功。2)本专利技术采用10％TCA/丙酮沉淀浓缩上清中的蛋白，并将pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000菌液，上清、沉淀及pMG36e空质粒的菌液，上清和沉淀分别制样进行SDS-PAGE分析，结果表明浓缩后的蛋白在48-65kDa之间有两条带，表明有目的蛋白的表达。3)本专利技术分别将pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000的菌液，上清、沉淀及浓缩蛋白和pMG36e/NZ9000菌液，上清、沉淀作为阴性对照，用生理盐水作为空白对照分别加入CMC-Na/GM17与微晶纤维素/GM17固体培养基30℃孵育反应后。pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000上清、pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000浓缩后的蛋白以及pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000菌液出现明显的水解圈，且浓缩后的水解圈直径大于pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000上清的水解圈直径，表明该酶具有一定的酶活力。4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，其特征在于包括如下步骤：/n1)提取牛瘤胃混合微生物总DNA；/n2)以总DNA为模板扩增得到cbh基因与eg基因片段，将其与乳酸菌信号肽usp45一同整合至表达载体pMG36e中，构建出分泌型表达载体pMG36e::eg::cbh；/n3)将测序正确后的重组质粒电转导入乳酸如球菌L.lactis NZ9000，得pMG36e::eg::cbh/L.lactis NZ9000重组菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，其特征在于包括如下步骤：
1)提取牛瘤胃混合微生物总DNA；
2)以总DNA为模板扩增得到cbh基因与eg基因片段，将其与乳酸菌信号肽usp45一同整合至表达载体pMG36e中，构建出分泌型表达载体pMG36e::eg::cbh；
3)将测序正确后的重组质粒电转导入乳酸如球菌L.lactisNZ9000，得pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ9000重组菌株。


2.根据权利要去1所述的一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，其特征在于所述牛瘤胃微生物纤维素酶基因由烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因与多粘类芽孢杆菌杆菌内切-β-1,4-葡聚糖酶基因共同组成。


3.根据权利要去1所述的一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，其特征在于所述乳酸菌受体菌为乳酸乳球菌L.lactisNZ9000。


4.根据权利要求1、2或3所述的一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，其特征在于包括如下步骤：
1)提取牛瘤胃混合微生物总DNA；
2)以总DNA为模板扩增得到cbh基因与eg基因片段，将其与乳酸菌信号肽usp45一同整合至表达载体pMG36e中，构建出分泌型表达载体pMG36e::eg::cbh；
3)将测序正确后的重组质粒电转导入乳酸如球菌L.lactisNZ9000，得pMG36e::eg::cbh/L.lactisNZ90...

【专利技术属性】
技术研发人员：王川，万学瑞，魏亚琴，邹爱爱，孙康永杰，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62