单质粒CRISPR-Cas9基因编辑工具及在异化金属还原菌中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种耗时短，效率高的可控消除单质粒CRISPR‑Cas9基因编辑工具，及其在异化金属还原菌中的多重基因编辑中的应用。本发明专利技术进一步涉及改善异化金属还原菌的胞外电子传递的方法，包括通过对同一菌株中Mtr传导复合物的形成，黄素的合成和NADH的生成中的关键基因实现多重基因编辑，得到胞外电子传递能力增强的菌株。

【技术实现步骤摘要】
单质粒CRISPR-Cas9基因编辑工具及在异化金属还原菌中的应用
本专利技术属于基因编辑领域，涉及一种单质粒可控消除CRISPR-Cas9基因编辑工具，及其在异化金属还原菌的基因编辑中的应用，以及增强异化金属还原菌的胞外电子传递的基因工程方法。
技术介绍
异化金属还原菌(DissimilatoryMetalReducingBacteria,DMRB)是一类利用胞外金属氧化物进行呼吸并储存能量用于生长、代谢的微生物。DMRB经底物代谢产生的电子通常需要经过复杂的电子传递网络传递给胞外电子受体。除金属氧化物外，DMRB还可以将电子传递给金属离子、电极以及多种污染物。因此，它们在重金属(包括放射性核素)去除、生态修复和能源回收中具有巨大的应用价值。S.oneidensisMR-1是DMRB中研究最为广泛的模式菌株之一，它通过Mtr(Metalreducing)呼吸途径中的细胞色素c(c-Cyts)复合物、胞外黄素电子穿梭体将胞内底物代谢产生的电子传递到胞外金属氧化物和污染物等电子受体。然而，由于野生型S.oneidensisMR-1的胞外电子传递(ExtracellularElectronTransfer,EET)效率较低，限制了其在污染修复中的实际应用。为了提高DMRB的EET能力，研究者已经开发出多种方法，如添加电子穿梭体和电子供体、优化黄素合成途径、促进NADH电子池再生、调节胞内第二信使Cyclic-di-GMP生成等。虽然这些方法已经取得了一些有价值的进展，但由于缺乏可用的基因组编辑工具，DRMB合成生物工程方面仍处于起步阶段。目前，对于DMRB遗传改造的研究大多是基于质粒完成的，需要抗生素来维持其稳定性，这不仅增加了潜在的使用成本，也会引起抗生素抗性基因的水平转移。为满足环境应用的实际需求，DMRB的基因工程应在无抗生素标记的条件下完成。因而，不涉及质粒、不使用相关抗生素标记物的基因组原位编辑，在DMRB基因工程中有巨大的研究价值和应用潜力。CRISPR-Cas9/Cpf1(成簇的有规则间隔短回文重复序列)已经成为一个强大的基因组编辑工具，极大的扩展了真核和原核生物的基因工程。经典的II型CRISPR系统来源于酿脓链球菌，包含了一个由RNA引导的核酸内切酶(spCas9)及一个由crRNA和tracrRNA组成的sgRNA。spCas9核酸内切酶基于PAM序列(前间隔序列邻近基序，核酸序列形式为NGG)和N20序列(前间隔序列，为PAM序列5'端的20个碱基)靶向目标DNA序列，并在PAM序列相邻的位点切割DNA序列，启动胞内DNA修复程序。在DNA修复模板存在时，可促使同源重组的修复发生，进而实现任意基因组位点的精确编辑。
技术实现思路
专利技术人建立了一个工程化的高效可控消除单质粒基因编辑工具Easy-to-editCRISPR-Cas9，并利用其在S.oneidensisMR-1中进行了多基因编辑，获得了EET能力大幅提升的S.oneidensisMR-1菌株，实现了基因组范围内的工程设计和EET网络优化。具体而言，例如，在该基因编辑工具中包含控制消除模块，编辑蛋白模块，目标操作模块和骨架模块，其中，控制消除模块含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶(例如，I-SceI核酸内切酶)编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两个终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列，目标操作模块中，在上游同源臂与下游同源臂之间含有用于插入目标基因片段的位点。该基因编辑工具在工作时，首先通过诱导物2启动编辑蛋白模块(例如，利用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑)对目标基因进行编辑，在编辑后可以利用对应控制归巢核酸内切酶的严谨调控型启动子的另一诱导物1激活控制消除模块。而后，所述归巢核酸内切酶得以表达，进而识别在质粒上的归巢核酸内切酶识别位点并进行切割，形成双链DNA断裂。DNA断裂的载体进而从菌体细胞中降解、消除。作为结果，能够获得基因组进行了工程化编辑，且无载体残留的细胞。所述Easy-to-editCRISPR-Cas9可控消除基因编辑工具是一步性的，其简单、可靠、快速并且高效。通过将以上单元设计在同一个质粒中形成单编辑工具，不仅有利于质粒的构建和连接，也使实验操作更加简单，降低了所需的人力物力，并节约了时间。随后，专利技术人利用该系统编辑了DMRB，尤其是S.oneidensisMR-1菌株的基因组，并依次在编辑后的菌株上递加编辑，从而分别获得了一系列的基因组编辑菌株。具体而言，对涉及Mtr传导复合物的形成，黄素的合成和NADH的生成中的关键基因进行了编辑。其中，将Mtr传导复合物的形成对应的菌株命名为MR-1/cymA，MR-1/OmcA，SM菌株，增加黄素的合成后对应的菌株命名为MR-1/RibDE，MR-1/RibBA，SMR，再次增加NADH的生成后对应的菌株命名为SMRN。试验发现，经编辑菌株能够如编辑前地生长，其EET能力增强(例如，相比于野生菌株，SM，SMR，SMRN具有更高的电流输出能力，更高的最大电流密度，更低的界面电荷转移阻力)。这些经编辑的菌株同时显示了U(VI)还原能力的增强，例如能够实现U(VI)的完全还原，一级速率常数(k)比野生菌株高1.84、1.99和3.62倍等。以上证实，所述可控消除基因编辑工具能够高效地适用于细胞，例如DMRB菌株细胞的基因组编辑，尤其是能够实现以无痕的方式对同一株进行安全的连续多重编辑，不残存质粒，不使用相关抗生素标记，耗时短，效率高。本专利技术涉及以下内容。1.基因编辑工具，其包含控制消除模块，编辑蛋白模块，目标操作模块和骨架模块，其中，控制消除模块含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两个终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列，目标操作模块含有：插入位点上游同源臂(1kbUHR)；插入位点下游同源臂(1kbDHA)；gRNA(向导RNA，中间含有N20序列)；骨架模块含有抗性基因表达盒(例如Km-R)，Mob，rep，终止序列(例如终止子茎环)，目标操作模块中，在上游同源臂与下游同源臂之间含有用于插入目标基因片段的位点。2.根据项1所述的基因编辑工具，其中，上述全部模块位于同一个载体中，所述编辑蛋白为Cas9蛋白，编辑蛋白模块含有Cas9蛋白表达盒和诱导启动子2(例如lacI-PLAC)的表达盒。3.根据项1或2所述的基因编辑工具，其中，在控制消除模块中，所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI，所述I-SceI在所述严谨调控型启动子控制下，优选所述归巢核酸内切酶识别序列为SEQIDNo.1所示的序列，所述严谨调控型启动子为诱导启动子1(例如araC-PBAD启动子)，所述两个终止子分别为rrnbT2终止子和T1T2终止子。4.根据项1～3中任一项所述的基因编辑工具，其中，所述可控消除基因编辑工具所编辑的细胞为革本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因编辑工具，其包含控制消除模块，编辑蛋白模块，目标操作模块和骨架模块，其中，/n控制消除模块含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两个终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列，/n目标操作模块含有：插入位点上游同源臂(1kb UHR)；插入位点下游同源臂(1kb DHA)；gRNA(向导RNA，中间含有N20序列)；/n骨架模块含有抗性基因表达盒(例如Km-R)，Mob，rep，终止序列(例如终止子茎环)，/n目标操作模块中，在上游同源臂与下游同源臂之间含有用于插入目标基因片段的位点。/n

【技术特征摘要】
1.基因编辑工具，其包含控制消除模块，编辑蛋白模块，目标操作模块和骨架模块，其中，
控制消除模块含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两个终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列，
目标操作模块含有：插入位点上游同源臂(1kbUHR)；插入位点下游同源臂(1kbDHA)；gRNA(向导RNA，中间含有N20序列)；
骨架模块含有抗性基因表达盒(例如Km-R)，Mob，rep，终止序列(例如终止子茎环)，
目标操作模块中，在上游同源臂与下游同源臂之间含有用于插入目标基因片段的位点。


2.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其中，上述全部模块位于同一个载体中，所述编辑蛋白为Cas9蛋白，编辑蛋白模块含有Cas9蛋白表达盒和诱导启动子2(例如lacI-PLAC)的表达盒。


3.根据权利要求1或2所述的基因编辑工具，其中，
在控制消除模块中，所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI，所述I-SceI在所述严谨调控型启动子控制下，优选所述归巢核酸内切酶识别序列为SEQIDNo.1所示的序列，
所述严谨调控型启动子为诱导启动子1(例如araC-PBAD启动子)，所述两个终止子分别为rrnbT2终止子和T1T2终止子。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因编辑工具，其中，所述可控消除基因编辑工具所编辑的细胞为革兰氏阴性菌，优选为异化金属还原菌。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的基因编辑工具，其中，
其中，控制消除模块来自pEM106质粒，工具蛋白模...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞汉青，范阳阳，汤强，刘东风，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34