一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用，属于新型生物药物工程技术领域。本发明专利技术是以大肠杆菌‑乳酸菌穿梭型表达载体pMG36e为基础，通过敲除红霉素抗性基因，替换成lacZ基因，并插入人胰岛素基因与pgsA基因，构建无抗性基因的食品级pMG36‑LacZ‑INS‑pgsA重组表达载体，电转化进乳酸乳球菌MG1363中获得食品级重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36‑LacZ‑INS‑pgsA实现人胰岛素基因在乳酸菌表面展示表达。实验证明，该重组乳酸菌可刺激NOD小鼠特异性抗体产生和免疫耐受形成。

【技术实现步骤摘要】
一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用
本专利技术属于新型生物药物工程
，具体涉及一种人胰岛素重组表达载体、表达人胰岛素的重组乳酸菌及应用。
技术介绍
近年来糖尿病的发病机理已经研究得较为透彻。I型糖尿病是一种自身免疫性疾病，是自身的T细胞过度反应从而选择性破坏胰腺中产胰岛素的β细胞，从而导致胰岛素的绝对缺乏。Ⅱ型糖尿病主要由于胰岛素抵抗β细胞分泌缺陷导致胰岛素出现相对不足引起。研究发现，通过口服胰岛素能够减轻或延缓糖尿病发病过程，其机制是胰岛素抗原通过黏膜Peyer’s区吸收，从而激活黏膜免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐受，从而保护胰岛细胞不被损伤。但是直接口服胰岛素，胰岛素蛋白分子在经过胃肠环境时，由于蛋白酶和胃酸作用会发生明显的降解，严重影响胰岛素抗原的有效作用。乳酸菌作为重要的益生菌已广泛的用于食品、饮料、微生态制剂等行业中，被公认为是安全的(GRAS)食品级微生物。近年来有关乳酸菌的研究已涉及生物学和医学的各个领域，利用乳酸菌表达重要的医药功能蛋白以赋予乳酸菌新的生理功能是开发乳酸菌应用的新领域。乳酸菌安全、无内毒素，表达的外源蛋白不需经过纯化可以直接连同菌体一起服用，且乳酸菌可以在肠道中定植存活，口服基因工程乳酸菌后其表达的用于治疗或免疫作用的蛋白就可以源源不断在肠道中产生并起到相应作用，为口服途径预防和治疗糖尿病提供新的思路。这样的表达系统要求食品级的宿主能用于食品、无抗生素基因、无有害化合物产生、能适用于大规模工业生产和医药食品工业。因此，表达宿主菌必须是安全的、特征清楚且稳定的食品及微生物，如乳酸乳球菌、乳酸杆菌及其他已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株；载体必须是食品级的，不能有非食品级的功能性DNA存在，与食品及表达系统有关的DNA必须来源于食品级(GRAS)微生物；诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、NISIN等可被人食用或对人无害的物质，或温度、酸诱导等对人体无害的条件。传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，但将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物安全性的严重后果，所以从食品安全性考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食品生产中。pMG36e是一种大肠杆菌-乳酸菌穿梭型表达载体，是在pWV01基础上人工改造获得，主要由强启动子p32、多克隆位点、pWV01复制子、下游的部分开放阅读框、来自于乳酸乳菌乳脂亚种的蛋白酶基因的转录终止子和来自于质粒pE194的红毒素抗性基因Emr六部分构成，质粒大小约为3.6kb，能够把外源蛋白在多种细菌中进行表达。目前已利用pMG36e实现多种外源目的基因在乳酸菌中的表达。由于pMG36e带有红霉素抗性基因，其投放到环境或人和动物体内将会带来严重的生物安全隐患，这需要一种对人体及环境安全的食品及筛选标记来构建表达载体。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种不含抗性基因筛选标记的人胰岛素重组表达载体；以及将该重组表达载体转化乳酸菌制得的食品级的能够表达人胰岛素的重组乳酸菌。本专利技术的重组表达载体为食品级人胰岛素重组表达载体；将该重组载体电转进食品级乳酸乳球菌MG1363中获得可菌体表面展示表达人胰岛素的食品级重组乳酸乳球菌。将其制成疫苗，可以通过口服途径补充胰岛素，并激活肠道黏膜免疫系统，引发口服耐受从而保护胰岛不被损伤。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种人胰岛素重组表达载体，所述重组表达载体是在无抗性基因筛选标记的表达载体上插入人胰岛素基因和pgsA基因；所述人胰岛素基因的核酸序列如SEQIDNo:2所示；所述pgsA基因的核酸序列如SEQIDNo:3所示。在上述方案的基础上，所述表达载体为经过改造不含有红霉素抗性基因的pMG36e载体。在上述方案的基础上，所述不含有红霉素抗性基因的pMG36e载体的改造方法为：(1)以嗜酸乳杆菌总RNA为模板，设计含有酶切位点的特异性引物，克隆β-半乳糖甘酶基因lacZ；(2)根据pMG36e载体序列设计含有酶切位点的特异性引物，扩增除红霉素抗性基因以外的片段；(3)将步骤(1)克隆获得的lacZ基因片段与步骤(2)克隆的片段进行酶切后，连接，即得改造后的不含有红霉素抗性基因的pMG36e载体。在上述方案的基础上，所述步骤(1)中的含有酶切位点的特异性引物为：Pl：5'-GCGAATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTATCACG-3'；P2：5'-AAAAGAATTCCTAATTTCTCAATACTTGAACATCC-3'；所述步骤(2)中的含有酶切位点的特异性引物为：P3：5-TACGTCGATCGAATTCGGTCCT-3'；P4：5'-CGCGAATTCATGCATAAACTGCATCCCTTA-3'。一种表达人胰岛素的重组乳酸菌，所述重组菌是由上述任一项所述的重组表达载体转化导入到乳酸菌中所得。在上述方案的基础上，所述乳酸菌为乳酸乳球菌MG1363。在上述方案的基础上，所述重组菌为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)HL20010，保藏编号为CCTCCNO：M2020967。上述表达人胰岛素的重组乳酸菌在制备预防和治疗I型糖尿病口服疫苗中的应用。一种表面展示重组人胰岛素的乳酸菌，是发酵上述的重组乳酸菌使重组人胰岛素在乳酸菌表面展示。本专利技术技术方案的优点：本专利技术的重组表达载体为食品级人胰岛素重组表达载体；将该重组载体电转进食品级乳酸乳球菌MG1363中获得可菌体表面展示表达人胰岛素的食品级重组乳酸乳球菌。将其制成疫苗，可以通过口服途径补充胰岛素，并激活肠道黏膜免疫系统，引发口服耐受从而保护胰岛不被损伤。本专利技术将pMG36e载体的抗性筛选标记基因Emr剔除，并将β-半乳糖苷酶基因(LacZ)重组到该载体上，作为筛选标记，消除了pMG36e载体中抗性基因带来的安全隐患；其中，β-半乳糖苷酶基因编码的产物能水解X-gal呈现蓝色，易于检测和观察；聚-γ-谷氨酸合成酶A(Po1y-γ-G1utamicA，pgsA)的N端第26-42氨基酸残基处有一个跨膜区，该跨膜区的存在为其成为细菌表面展示元件创造了条件，本专利技术将pgsA基因进一步构建到重组载体上，可以使表达的胰岛素锚定在乳酸菌表面；整个重组表达载体和重组菌均为食品安全级，为研究口服胰岛素制剂的研发奠定了理论基础。附图说明图1为实施技术路线；图2为重组质粒构造示意图；图3NOD小鼠血清中重组人胰岛素特异性抗体和IL-4水平分析。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胰岛素重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是在无抗性基因筛选标记的表达载体上插入人胰岛素基因和pgsA基因；/n所述人胰岛素基因的核酸序列如SEQ ID No:2所示；/n所述pgsA基因的核酸序列如SEQ ID No:3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人胰岛素重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是在无抗性基因筛选标记的表达载体上插入人胰岛素基因和pgsA基因；
所述人胰岛素基因的核酸序列如SEQIDNo:2所示；
所述pgsA基因的核酸序列如SEQIDNo:3所示。


2.根据权利要求1所述人胰岛素重组表达载体，其特征在于，所述无抗性基因筛选标记的表达载体为经过改造不含有红霉素抗性基因的pMG36e载体。


3.根据权利要求2所述人胰岛素重组表达载体，其特征在于，所述不含有红霉素抗性基因的pMG36e载体的改造方法为：
(1)以嗜酸乳杆菌总RNA为模板，设计含有酶切位点的特异性引物，克隆β-半乳糖甘酶基因lacZ；
(2)根据pMG36e载体序列设计含有酶切位点的特异性引物，扩增除红霉素抗性基因以外的片段；
(3)将步骤(1)克隆获得的lacZ基因片段与步骤(2)克隆的片段进行酶切后，连接，即得改造后的不含有红霉素抗性基因的pMG36e载体。


4.根据权利要求3所述人胰岛素重组表达载体，其特征在于，所述步骤(1)中的含有酶切位点的特异性引物为：
Pl：5'-GCGAATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTATCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明义，刘刚，马凤龙，崔晓辰，张惠，夏玉洁，宗绍波，王晓茹，
申请(专利权)人：青岛海华莱康生物医药技术有限公司，青岛海华生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37