一种表达SEF14功能性菌毛的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种重组质粒，重组质粒为将

【技术实现步骤摘要】
一种表达SEF14功能性菌毛的重组菌及其应用
本专利技术属于生物医学和免疫诊断检测
，具体涉及一种表达SEF14功能性菌毛的重组菌及其应用。
技术介绍
肠炎沙门氏菌没有宿主特异性，是导致人类食物中毒的主要的病原菌之一，能引起人和畜禽的非伤寒型胃肠炎。全世界每年大约有9380万人感染沙门氏菌，15.5万人死亡；而在我国，每年由沙门氏菌导致的沙门氏菌胃肠炎约占细菌性食物中毒的40％，居细菌性食物中毒之首，而肠炎沙门氏菌是沙门氏菌食物中毒暴发的主要病原。畜禽产品是肠炎沙门氏菌感染的主要来源，其中以鸡蛋携带最为常见，这是由于肠炎沙门氏菌可以导致雏鸡的全身感染并终生带菌，细菌可以通过卵巢垂直传播至鸡蛋。若鸡蛋被查出肠炎沙门氏菌污染，同批次鸡蛋面临的后果是全部召回和销毁，例如2010年8月美国10个州爆发了沙门氏菌感染事件，5亿枚“问题蛋”被召回。因此，肠炎沙门氏菌引起人类食物中毒的同时也会导致畜禽养殖的重大损失，解决这个问题的关键是尽早检出，尽早淘汰。然而，目前没有系统特异性性的鸡群肠炎沙门氏菌的检测监测技术。沙门氏菌检测方法众多，但对于沙门氏菌感染现场检测来说，凝集试验的便捷性具有无可比拟的优势。临床上通常会采用全血平板凝集试验检测鸡白痢沙门氏菌感染，但在实际应用中也被报道出现交叉反应明显、各批次检测结果不一致、弱阳性漏检等情况，且该法对雏鸡存在较大检测误差。值得注意的是，限于直接凝集试验敏感性局限，通常在种鸡产蛋前(16周龄)进行检查并考虑阳性种鸡群的净化根除。综上所述，究其根源是因为上述凝集抗原是全菌抗原(非纯净抗原)，非单因子成分，与多种属细菌和其它成分的非特异性交叉复杂。因此开发一种结果可靠、操作简便且反应快速的肠炎沙门氏菌现场检测方法，即简易、经济、即时、特异、敏感的凝集试验的监测检测，仅肉眼2分钟内在现场完成结果判定，并使之标准化，对于种鸡场肠炎沙门氏菌净化工作顺利开展、养禽业的长足发展和禽蛋产品的安全保障十分必要。目前肠炎沙门氏菌在鸡群的感染情况严峻，对人类食品安全带来了严峻的考验，但是目前缺乏特异靶向性的鸡群肠炎沙门氏菌感染检测监测技术将其净化。SEF14菌毛是一种伴侣-推进(chaperone-usher)菌毛，由sefABCD操纵子编码，是肠炎沙门氏菌感染过程中重要的毒力因子。本专利技术调研发现在鸡群分离到的沙门氏菌血清型中，仅肠炎沙门氏菌中存在完整的sef14操纵子，而在鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌中均存在假基因(未发表试验数据和分析)，理论上说，它们都不会在细菌体内表达SEF14菌毛，在感染鸡体内也不会产生SEF14菌毛抗体。因此，SEF14抗体具有作为肠炎沙门氏菌感染特异性检测靶标，意义重大。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术将功能性菌毛SEF14单一表达在惰性载体菌S9(该菌株的保藏编号为CGMCCNo.17340)上可以避免出现背景反应的同时特异性检测肠炎沙门氏菌感染，具有快速、特异、敏感、简单和价廉等优点，同时满足鸡群肠炎沙门氏菌感染现场和大规模、大批量、快速检测的要求。因此，基于SEF14菌毛靶标的肠炎沙门氏菌检测监测技术具有巨大的应用前景。本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种重组质粒。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种重组菌株及其制备方法和应用。技术方案：本专利技术提供了一种重组质粒，所述重组质粒为将sef14操纵子基因插入表达载体pBR322中即得。本
技术实现思路
还包括一种重组菌株，所述重组菌株为将所述重组质粒导入惰性载体菌S9即得。本
技术实现思路
还包括所述的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：1)PCR扩增sef14操纵子基因并将其连接T载体，DNA测序鉴定正确后插入表达载体pBR322，构建重组质粒pBR-sef14；2)将pBR-sef14导入大肠杆菌SE5000，热提取菌毛并利用SDS-PAGE、Westernblot和透射电镜鉴定SEF14菌毛的正确表达；3)将pBR-sef14导入惰性载体S9即得。其中，所述步骤1)中的PCR扩增、下游引物序列分别为sef-up：5’-GGCATGCAAAATggCgTgAgTATATTAgCATCCgCA-3’；sef-lo：5’-CGTCGACTTATTATAATTCAATTTCTGTCGCATAT-3’；其中下划线标注分别代表SphI和SaI酶切位点。其中，对表达SEF14菌毛的SE5000重组菌热提取菌毛后经SDS-PAGE和Westernblot鉴定的SEF14菌毛亚单位大小为14.3KD。其中，表达SEF14菌毛的SE5000重组菌可在透射电镜下观察到明显的菌毛结构；而仅含pBR322载体的SE5000重组菌观察不到菌毛结构。其中，在步骤3)中，通过电转化将pBR-sef14导入惰性载体菌S9电转化感受态细胞并通过氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆。其中，表达SEF14菌毛的惰性载体菌液仅与肠炎沙门氏菌感染阳性鸡血清混合后可以形成肉眼可见凝集颗粒状沉淀；表达SEF14菌毛的惰性载体菌液与鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌感染血清或SPF鸡血清混合后均不会形成肉眼可见颗粒状沉淀。本专利技术构建的pBR-sef14质粒具有氨苄青霉素抗性，质粒全长8212bp。PCR扩增的sef14操纵子片段和pBR322载体经SphI和SalI酶切后利用T4DNA连接酶在体外环化并转化大肠杆菌SE5000后通过氨苄亲霉素抗性LB平板筛选阳性克隆。pBR-sef14质粒的鉴定方法为分别利用存在于载体pBR322上的SalI和存在于sef14操纵子的SphI进行酶切，然后经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，酶切后目的条带均为8212bp。本
技术实现思路
还包括所述的重组质粒或重组菌株在制备凝集试验试剂或试剂盒中的应用。本
技术实现思路
还包括所述的重组质粒或重组菌株在制备肠炎沙门氏菌感染鉴定或检测试剂或试剂盒中的应用。其中，所述的应用为，将重组菌株与多种沙门氏感染鸡血清和SPF鸡血清进行凝集试验，当出现凝集颗粒状沉淀时，即感染肠炎沙门氏菌，反之，则没有感染肠炎沙门氏菌。本专利技术的表达SEF14菌毛的惰性载体菌液仅与肠炎沙门氏菌感染阳性鸡血清混合后可以形成肉眼可见凝集颗粒状沉淀；本专利技术的表达SEF14菌毛的惰性载体菌液与同群D群鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染血清，多种沙门氏菌感染鸡血清或SPF鸡血清混合后均不会形成肉眼可见凝集颗粒状沉淀。有益效果：本专利技术首次将SEF14菌毛单一成分在惰性载体菌S9进行了表面展呈表达。本专利技术的重组菌与各种品种的鸡血清或任何非肠炎沙门氏菌病原感染的鸡血清均不发生反应，所以可避免出现背景反应的同时特异性检测肠炎沙门氏菌，该惰性载体沙门氏菌S9也是申请人的早期专利技术，本专利技术是基于该早期申请专利基础上的创新、新颖性发现和进一步应用，本专利技术将该惰性载体沙门氏菌S9进行具体试验验证并表达该SEF14菌毛在惰性载体菌S9表面进行表达，并创造性的发现其能够表达SEF14功能性菌毛单一成分的重组菌并且仅特异性与肠炎沙门氏菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将sef14操纵子基因插入表达载体pBR322中即得。


2.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为将权利要求1的重组质粒导入惰性载体菌S9即得。


3.权利要求2所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）PCR扩增sef14操纵子基因并将其连接T载体，DNA测序鉴定正确后插入表达载体pBR322，构建重组质粒pBR-sef14；
2）将pBR-sef14导入大肠杆菌SE5000，热提取菌毛并利用SDS-PAGE、Westernblot和透射电镜鉴定SEF14菌毛的正确表达；
3）将pBR-sef14导入惰性载体S9即得。


4.根据权利要求3所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中的PCR扩增、下游引物序列分别为
sef-up：5’-GGCATGCAAAATggCgT...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯千禧，顾宣强，朱国强，刘家奇，段强德，夏芃芃，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32