用于表达荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物监测技术领域，具体为一种在肉葡萄球菌用于稳定表达荧光蛋白的质粒及其构建方法和应用。本发明专利技术将启动子Peftu片段、信号肽Tat片段、信号肽Sec片段和红色荧光蛋白DsRed的突变体DsRed‑Monomer片段，构建得到质粒pBT2‑E‑DsRed‑M、pBT2‑E‑Tat‑DsRed‑M和pBT2‑E‑Sec‑DsRed‑M。通过将质粒转化到肉葡萄球菌中，使其能够表达单体红色荧光蛋白。该技术可以代替传统的染料标记，对肉葡萄球菌在发酵过程动态变化、葡萄球菌在细胞侵染以及动物侵染过程中的生物行为实现实时观察动态研究，并为肉葡萄球菌在合成生物学与系统生物学等领域的应用提供依据。

【技术实现步骤摘要】
用于表达荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒及其构建方法和应用
本专利技术属于生物监测
，特别涉及一种用于荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
葡萄球菌(Staphylococcus)是一群革兰氏阳性球菌，因常常堆聚成葡萄串状而得名，无鞭毛，不能运动，也无芽孢。肉葡萄球菌不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是目前葡萄球菌属中被完全确认的食品级GRAS(generallyrecognizedassafe)菌株。肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)作为肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作生肉产品起始培养物已经超过60年。此外，由于肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解活性，所以肉葡萄球菌还可以用作良好的基因工程宿主菌。作为选择性的克隆宿主菌，不仅可以在分子遗传学方面用来研究葡萄球菌属相关代谢途径，而且还能用于异源蛋白的表达和分泌。根据信号肽的结构，可将其分为分泌型(Sec)信号肽、双精氨酸转运(twin-argininetransolcation，Tat)信号肽和脂蛋白(Lip)信号肽等。Sec转运系统只能转运未折叠或部分折叠的蛋白质，而Tat转运系统可将处于正确折叠状态的蛋白质转运到细胞外，在基因工程领域中可以用于分泌无法通过Sec系统转运的外源蛋白。DsRed-Monomer是天然四聚体DsRed的一个单体变体。它是一种28kDa的自荧光蛋白，具有宽的激发和发射带。它比天然的DSRed更快地成熟，并且pH和温度(高达37℃)是稳定的。其DNA序列含有678bp构成的开放阅读框(ORF)。基于DsRe-Monomer的标记系统的优点包括：可以灵活地将目标蛋白连接到任何一个末端，能够执行位点特异性的基因编码，以及由于其在光谱的红色区域的激发-发射，实现了比低细胞自荧光更有效的检测。目前，国内外尚无DsRed-Monomer基因在肉葡萄球菌中表达的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了在肉葡萄球菌中用于表达单体红色荧光蛋白的质粒以及能够表达荧光蛋白的启动子与信号肽。本专利技术的目的之二在于提供了用于表达单体红色荧光蛋白的构建方法。本专利技术的目的之三在于表达荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒的应用。本专利技术的技术方案如下：用于在肉葡萄球菌中表达单体红色荧光蛋白质粒，所述载体为pBT2质粒，所述pBT2质粒的序列号为SEQIDNO.1。用于在肉葡萄球菌中表达单体红色荧光蛋白的质粒构建方法具体方法如下：(1)启动子Peftu的制备使用含KpnI酶切位点的引物Peftu-F和含BamHI酶切位点的引物Peftu-A对ufA基因的启动子Peftu片段进行扩增、回收，得到启动子Peftu片段。其中，Peftu-F：Peftu-R：(2)信号肽Tat基因的制备使用含BamHI酶切位点的引物Tat-F和含HindIII酶切位点的引物Tat-A，对来自肉葡基因组中的铁离子依赖型的过氧化物酶(FepBorEfeB，Sca2214)中的Tat片段进行扩增、回收，得到信号肽Tat片段。其中，Tat-F：Tat-R：(3)信号肽Sec基因的制备使用含BamHI酶切位点的引物Sec-F和含HindIII酶切位点的引物Sec-A，对来源于S.hyicussubsp.hyicusDSM20459的脂肪酶基因shl中的Sec片段进行扩增、回收，得到信号肽Sec片段。其中，Sec-F：Sec-R：(4)DsRed-Monomer基因片段的制备使用含BamHI酶切位点的引物DsRed-M-F1与含HindIII酶切位点的引物DsRed-M-F2和含XbaI酶切位点His-tag的引物DsRed-M-A，对来自于香菇珊瑚(Discosomasp.)的红色荧光蛋白DsRed的突变体DsRed-Monomer片段进行扩增、回收，得到DsRed-Monomer片段。其中，DsRed-M-F1：DsRed-M-F2：DsRed-M-R：(5)质粒的构建将步骤(1)、(2)、(3)和(4)中回收的片段启动子Peftu片段、信号肽Tat片段、信号肽Sec片段和DsRed-Monomer片段，分别酶切连接在pBT2载体上。构建得到含启动子与红色荧光蛋白质粒pBT2-E-DsRed-M、含启动子与信号肽Tat与红色荧光蛋白质粒pBT2-E-Tat-DsRed-M和含启动子与信号肽Sec与红色荧光蛋白质粒pBT2-E-Sec-DsRed-M，序列号分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。(6)质粒化学转化大肠杆菌与鉴定将连接好的质粒pBT2-DsRed-M、pBT2-Tat-DsRed-M和pBT2-Sec-DsRed-M化学转化至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态，于Amp抗性LB平板上培养12h。之后进行菌落PCR及其产物测序，得到E-DsRed-M、E-Tat-DsRed-M和E-Sec-DsRed-M，使用质粒提取试剂盒得到稳定的质粒。(7)质粒电转化至肉葡萄球菌将(6)中得到的质粒分别电转化至肉葡萄球菌(S.carnosus)TM300感受态，于Cm抗性TSB平板(酪蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，琼脂20g/L)上培养16h，之后进行PCR及其产物测序验证。得到S.carnosusTM300/pBT2-E-DsRed-M、S.carnosusTM300/pBT2-E-Tat-DsRed-M和S.carnosusTM300/pBT2-E-Sec-DsRed-M三株重组菌株。本专利技术的有益效果是：成功构建了带有DsRed-Monomer基因的表达载体pBT2-E-DsRed-M、pBT2-E-Tat-DsRed-M和pBT2-E-Sec-DsRed-M。单体红色荧光蛋白具有穿透能力强、成熟速率快、受pH值影响小、检测方便的特点，在激发光作用下发出红色荧光，细胞毒性小，呈现单体状态，适于作为研究蛋白的融合标签，有助于探索异源蛋白的表达，发酵过程的动态监控，并且为葡萄球菌感染宿主的致病机理奠定了基础。附图说明图1本专利技术实施例中pBT2载体图谱。图2本专利技术实施例中pBT2-E-DsRed-M质粒图谱。图3本专利技术实施例中pBT2-E-Tat-DsRed-M质粒图谱。图4本专利技术实施例中pBT2-E-Sec-DsRed-M质粒图谱。图5本专利技术实施例中S.carnosusTM300/pBT2-E-DsRed-M菌株荧光显微观察。图6本专利技术实施例中S.carnosusTM300/pBT2-E-Tat-DsRed-M菌株荧光显微观察。图7本专利技术实施例中S.carnosusTM300/pBT2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于表达单体红色荧光蛋白的肉葡萄球菌穿梭质粒pBT2，其特征在于荧光蛋白的编码基因拥有启动子与信号肽的控制。其中所述启动子为ufA基因的启动子Peftu片段(GenBank Accession No：7551602)，其中所述信号肽为来自肉葡基因组中的铁离子依赖型的过氧化物酶(FepB or EfeB，Sca2214)中的Tat片段(GenBank Accession No：AM295250)，其中所述来源于S.hyicus subsp.hyicus DSM20459的脂肪酶基因shl的启动子Sec片段(GenBank Accession No：LS483304.1)，其中所述单体红色荧光蛋白为DsRed-Monomer(GenBank Accession No：AB711114.1)。所述穿梭质粒分别命名为pBT2-E-DsRed-M、pBT2-E-Tat-DsRed-M和pBT2-E-Sec-DsRed-M。所表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3。/n

【技术特征摘要】
1.用于表达单体红色荧光蛋白的肉葡萄球菌穿梭质粒pBT2，其特征在于荧光蛋白的编码基因拥有启动子与信号肽的控制。其中所述启动子为ufA基因的启动子Peftu片段(GenBankAccessionNo：7551602)，其中所述信号肽为来自肉葡基因组中的铁离子依赖型的过氧化物酶(FepBorEfeB，Sca2214)中的Tat片段(GenBankAccessionNo：AM295250)，其中所述来源于S.hyicussubsp.hyicusDSM20459的脂肪酶基因shl的启动子Sec片段(GenBankAccessionNo：LS483304.1)，其中所述单体红色荧光蛋白为DsRed-Monomer(GenBankAccessionNo：AB711114.1)。所述穿梭质粒分别命名为pBT2-E-DsRed-M、pBT2-E-Tat-DsRed-M和pBT2-E-Sec-DsRed-...

【专利技术属性】
技术研发人员：高强，安娅，王华敏，薛鲜丽，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12