创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法技术

本发明专利技术涉及一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法，该多基因编辑载体采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系，能够实现同时对番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因进行精确编辑，利用农杆菌介导的转化技术快速得到相关变异材料，丰富番茄育种资源，为番茄品种选育提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法
本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种创制番茄果实色泽育种材料的多基因编辑载体及方法。
技术介绍
番茄(Solanumlycopersicum)是全球广泛种植的蔬菜作物之一，营养丰富，可以用作烹饪和调料，受到广大消费者的喜爱。我国是世界上番茄生产和出口大国，番茄产量居世界第一。我国番茄育种工作开始较晚，但经过科研者三十多年的努力也取得了丰富的成果，先后育成了一系列优良品种。传统的植物遗传育种方法一般是基于现有的种质资源，后代优良农艺性状的选择效率偏低且周期较长，遗传改良的效率偏低。目前研究人员通过现代生物技术与传统育种方法结合，创新种质资源，提高了遗传改良效率、缩短了育种年限，在提高产量、改善品质、增强抗性等方面已显示出巨大潜力，成为现代作物育种的主要方向。如何培育优质高产多抗的番茄品种受到广大研究者的关注。分子育种主要分为两类：一类是分子标记育种，又称分子标记辅助选择(MAS)，通过构建分子遗传图谱实现基因/QTL定位甚至克隆，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记作为选择标记，在育种选育过程中，以标记信息为辅助信息，通过分子标记的筛选快速、准确地完成目标性状的选择并用于遗传改良；另一类是基因工程育种，主要以转基因、定向诱导基因组局部突变(TILLING)和基因组编辑等技术为代表，可以打破传统育种存在的生殖隔离、连锁累赘等因素的限制，实现对目标性状的高效精准遗传改良。近年来，基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑日益受到重视。由于编辑效率高、操作简便、成本低等特点，CRISPR/Cas9迅速成为当前最为主流的基因组编辑技术。目前CRISPR/Cas9系统已经在动物、植物、微生物及各种细胞中实现了应用。在针对番茄的研究中，研究人员大部分采用CRISPR/Cas单基因编辑系统，多基因编辑技术应用较少，难度较大。如何创建一个系统简单、操作便捷且编辑效率高的多基因编辑系统，以达到利用一个载体同时敲除多个基因的目的，在基因家族、通路的研究、作物改良等方面发挥着重要作用，因此多基因编辑系统的建立及优化对植物的研究具有重要意义。果实颜色是影响番茄外观品质的重要因素，番茄果实颜色的改良是番茄品种选育的最重要目标之一。目前，南方番茄市场绝大部分栽培番茄为红色，北方粉果番茄较多，难以满足消费者对果实颜色的多样性需求。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法，经一次试验可同时获得多种色泽的番茄育种材料，丰富番茄种质资源，实现番茄果色的高效遗传改良，满足番茄果实颜色的多样性需求。专利技术人团队通过研究发现利用番茄体内的内含子剪切系统和tRNA加工系统，构建串联排列的tRNA-gRNA构架，能够高效、精确串联多个gRNA指导Cas9蛋白进行多基因编辑，并应用于番茄育种和基础研究中。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体，其采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系实现同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因，所述PSY1基因的序列如SEQIDNO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQIDNO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供一种创制番茄果实色泽材料的方法，包括如下步骤：构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因编辑载体，所述PSY1基因的序列如SEQIDNO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQIDNO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQIDNO.3所示；利用农杆菌介导番茄遗传转化，获得番茄果实色泽材料。在其中一个实施例中，构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的多基因编辑载体包括如下步骤：以pGTR质粒为模板，采用如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的引物序列进行PCR扩增，扩增反应后挖胶回收目的基因片段，经酶切后连接pKSE401，转化大肠杆菌感受态，选取大肠杆菌阳性克隆进行质粒抽提，导入农杆菌感受态细胞培养，获得农杆菌阳性克隆。优选地，PCR扩增反应的程序依次为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃复性15s，72℃延伸30s，循环38次；72℃延伸5min。在其中一个实施例中，鉴定阳性克隆所采用引物序列分别如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示。在其中一个实施例中，鉴定番茄果色材料编辑位点所采用的引物序列分别如SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示。在其中一个实施例中，所述番茄遗传转化采用的受体材料为MicroTOM番茄。本专利技术的有益效果是：本专利技术构建了一个可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的多基因编辑系统，可经一次试验同时获得果实为黄色、棕色、粉色等多种色泽的番茄育种材料，便于加快育种进程，突破了传统番茄育种手段的障碍和缺点，具有广泛应用价值。附图说明图1为农杆菌克隆的PCR检测鉴定胶图。图2为多基因编辑载体pKSE401-3G的结构示意图。图3为番茄遗传转化示意图。图4为转基因番茄阳性植株的PCR鉴定胶图。图5为PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的靶点扩增鉴定胶图。图6为基因编辑番茄材料的植株表型图。图7为基因编辑番茄的果实颜色图。图8为PCR转基因成分的去除状况鉴定胶图。具体实施方式以下对本专利技术进行举例描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。实施例中未注明具体条件的实验方法，在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。实施例1本实施例提供一种多基因编辑载体pKSE401-3G的构建方法，包括如下步骤：S1，获取PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的序列信息。根据数据库CRISPR-P2.0设计目的基因的靶位点。其中，PSY1基因的序列如下：gatttcactatattgtaatattaacttgaggtcactataggagctcaaaaacttctaattttgaatcaatgtctggttatactttttttgtcataactgtatctcaaatgtggtgtttggtttatctcattttgcagaagtcaagaaacaggttactcctgtttg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因，所述PSY1基因的序列如SEQIDNO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQIDNO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQIDNO.3所示。


2.一种创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因编辑载体，所述PSY1基因的序列如SEQIDNO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQIDNO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQIDNO.3所示；
利用农杆菌介导番茄遗传转化，获得番茄果实色泽材料。


3.根据权利要求2所述的创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因编辑载体包括如下步骤：以pGTR质粒为模板，采用如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳波，罗金英，姚紫蕾，贾罕泽布·加法尔，卢永恩，叶志彪，郑伟，谢勇，李汉霞，
申请(专利权)人：武汉楚为生物科技股份有限公司，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42