一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用。所述表达载体包括pBDEN‑CP‑BZ、pBDEN‑CP‑BZ‑LcyEi和pBDEN‑CP‑CH‑LcyEi。本发明专利技术将载体中携带的功能基因及启动子转入玉米，选育的玉米籽粒中虾青素高达100μg/g玉米籽粒干重，是原报道的7倍左右，且虾青素均是以高生物活性的反式虾青素为主，这种富含高品质反式虾青素的玉米新种质将为填补我国虾青素需求缺口开辟新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种虾青素表达载体及其应用，并确定虾青素玉米最佳储存条件和生物利用的方法。
技术介绍
虾青素是一种类胡萝卜素，存在于各种藻类、微生物和水生动物中，在高等植物中鲜有报道(CunninghamandGantt,2011)。由于其出色的抗氧化能力和其他生物活性，虾青素作为一种营养补充剂广泛的应用于食品、饲料、保健品、药品和化妆品等产品中。虾青素在饲料工业中,可用作鲍鱼、鲟鱼、鲑鱼、虹鳟鱼、真鲷、甲壳类动物及观赏鱼类、各种禽类和生猪的饲料添加剂。根据体内和体外试验结果表明，虾青素对癌症、高血压、糖尿病、心血管、胃肠道、肝脏、神经退行性疾病和皮肤病等有潜在的积极影响(Ambatietal.,2014)。欧盟早已批准将虾青素作为人类膳食补充剂，并且美国食品和药物管理局已批准将虾青素用作动物和鱼类饲料中的食物着色剂，我国也在食品和饲料添加剂中大量使用虾青素。然而，在目前的虾青素供应中，化学合成的工艺复杂技术难度大、生物活性低且有安全风险；酵母发酵来源的产量和生物活性低且成品中含糖量过高；雨生红球藻提取也存在技术门槛高、产量不高以及总体成本过高的问题。因此，建立一种高产低成本、生物活性高易操作的虾青素生产体系具有重要意义。关于虾青素的基因工程研究率先在藻类和微生物中进行。在烟草、拟南芥等模式中均有成功进行的案例。玉米中也有一例关于虾青素基因工程的研究工作，该研究通过基因枪共转化的方式获得同时表达Crbkt和BrcrtZ（Brevundimonassp.,strainSD212）的转基因玉米籽粒积累16.8μg/g干重的虾青素(Farréetal.,2016)，但其存在转化方式带来的外源基因碎片化和基因分离的问题以及缺少对种质中的虾青素特性的评价，而我国在玉米中没有类似的研究服务于我国的虾青素市场需求。目前，华南农业大学刘耀光院士团队在水稻胚乳中成功重构了虾青素的代谢途径(Zhuetal.,2018)，其虾青素含量也只有16.0μg/g水稻干重，远不能满足生产的需要。虾青素的微生物生产方法虽然能产出高虾青素含量，但是，生物活性确很低，如GerhardSandmann等通过传统突变和代谢工程结合的办法，产生了一株虾青素干重达到9mg/g的菌株，是已知的产量最高的红发夫酵母。然而，由于红发夫酵母产生的虾青素为（3R,3′R）构型，抗氧化能力较低，限制了其在商业规模上的使用。专利201010150422.9公开了一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用，涉及一种微生物菌株及其获取方法。所述虾青素生产菌株为红法夫酵母的诱变菌株N1806-04。以红法夫酵母为出发菌株，采用酶法制备红法夫酵母原生质体，再通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得虾青素生产菌株，连续传代5次后虾青素的产量稳定。将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg，生物量可达80～110g/L。虽然上述微生物生产的虾青素含量远高于转基因植物种子中的含量，但是，其含有的活性反式虾青素含量低，且该虾青素只是细胞中的含量，还要提取出来才能应用于工业生产，提取的过程中虾青素活性又大量丧失，产率也不见得高于转基因植物的种子，而转基因玉米种子无需提取可以直接用于需要虾青素的饲料，比如高端水产养殖业的三文鱼配合饲料，虹鳟鱼饲料等，也可用于火烈鸟，家禽和宠物饲料等。另外，转基因玉米来源的虾青素没任何异味，藻类来源的有海腥味，酵母来源的有菌味。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种联合表达载体，用于在玉米作物中表达，促进其高效表达虾青素。本专利技术的目的还在于提供一种高效表达虾青素的玉米品种的选育方法。本专利技术的目的还在于提供玉米源虾青素最佳储存条件和生物利用的方法。一种虾青素表达载体，所述表达载体包括pBDEN-CP-BZ、pBDEN-CP-BZ-LcyEi、pBDEN-CP-CH-LcyEi。所述载体pBDEN-CP-BZ携带ZmPSY1、HpCrtZ、CrBKT、PaCrt1基因。所述载体pBDEN-CP-BZ-LcyEi携带ZmPSY1、HpCrtZ、CrBKT、PaCrt1基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列。所述载体pBDEN-CP-CH-LcyEi携带ZmPSY1、AdCBFD、AdHBFD、PaCrt1基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列。一种高效表达反式虾青素的玉米品种的选育方法，将所述表达载体通过农杆菌介导的方法进行玉米转化，随后将获得的有虾青素合成的玉米转化材料分别与主栽品种的父母本自交系回交转育，获得稳定遗传的转基因玉米株系。所述主栽品种为郑58、昌7-2、X335父本和X335母本。玉米源虾青素的稳定储存条件，从上述高效表达反式虾青素的玉米品种中提取虾青素，然后在-20℃条件下保存；或者所述高效表达虾青素的玉米品种的种子保存于4℃条件下。玉米源虾青素的应用，其作为畜禽养殖的饲料添加剂。本专利技术的有益效果：本专利技术通过多个玉米籽粒特异性双向启动子驱动来源于玉米的基因ZmPSY1和水仙花来源的基因CrtI表达增加了β胡萝卜素的生物合成量，另外通过对lcy-e基因LcyEi干扰限制番茄红素流向α胡萝卜素合成途径，从而实现“开源”和“截流”双管齐下的策略，增加虾青素合成的前体物质供应。同时，通过多个玉米籽粒特异性双向启动子分别驱动来源莱茵衣藻和雨生红球藻的虾青素合成结构基因CrBKT、HpCrtZ和来源于夏侧金盏花中两个基因AdCBFD和AdHBFD的表达，实现了虾青素高效生物合成，玉米籽粒中虾青素高达100μg/g玉米籽粒干重，是原报道的7倍左右。而且虾青素的同分异构体形式和雨生红球藻一致，均是高生物活性的反式虾青素为主。这种富含高品质虾青素的玉米新种质将为填补我国虾青素需求缺口开辟新的途径。附图说明图1为中间载体pBDEN-mtp结构示意图。图2为表达载体pBDEN-CP-BZ结构示意图。图3为表达载体pBDEN-CP-BZ-LcyEi结构示意图。图4为表达载体pBDEN-CP-CH-LcyEi结构示意图。图5为三种载体转基因选育的虾青素玉米。图6为在四个自交系背景下的BC4F1代pBDEN-CP-BZ-LcyEi虾青素玉米。图7为虾青素玉米中目的基因的PCR检测电泳图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。玉米（ZeamaysL.）自交系郑58、昌7-2、X335父本和X335母本为本专利技术实施例中的回交转育母本，杂交种HiII玉米则为本专利技术实施例中的起始受体材料（公众可从北京德农种业有限公司处获得）；ZmPSY1、PaCrtI、CrBKT、HpCrtZ、AdCBFD、A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虾青素表达载体，其特征在于，所述表达载体包括pBDEN-CP-BZ、 pBDEN-CP-BZ-LcyEi、pBDEN-CP-CH-LcyEi；/n所述载体pBDEN-CP-BZ携带

【技术特征摘要】
1.一种虾青素表达载体，其特征在于，所述表达载体包括pBDEN-CP-BZ、pBDEN-CP-BZ-LcyEi、pBDEN-CP-CH-LcyEi；
所述载体pBDEN-CP-BZ携带ZmPSY1、HpCrtZ、CrBKT、PaCrt1基因；
所述载体pBDEN-CP-BZ-LcyEi携带ZmPSY1、HpCrtZ、CrBKT、PaCrt1基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列；
所述载体pBDEN-CP-CH-LcyEi携带ZmPSY1、AdCBFD、AdHBFD、PaCrt1基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列。


2.一种高效表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳小庆，陈茹梅，李素贞，杨文竹，周晓今，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11