一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法技术

本发明专利技术提供了一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法；包括：1)构建带有BlpR基因的重组表达载体，转入农杆菌得到重组菌株；2)在无菌环境下，采用该重组农杆菌侵染甜瓜子叶近轴端片段，将侵染后的子叶片段置于共培养基上生长，得到膨大的子叶外植体；3)将膨大的外植体转移至分化筛选培养基上培养，诱导出丛生芽；4)将伸长的丛生芽分离成单株，转移、进一步筛选培养，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；5)将具有甜瓜地上部分的幼苗转入生根培养基中，诱导根的分化，得到T0代甜瓜转基因幼苗；6)通过草铵膦试纸和PCR双重鉴定T0代甜瓜转基因幼苗，得到完成遗传转化的株系。利用本发明专利技术的方法可以得到稳定转化的甜瓜幼苗。

A genetic transformation method of melon based on glufosinate as screening marker

【技术实现步骤摘要】
一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法
本专利技术属于植物分子遗传育种和基因工程
，涉及一种甜瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法，具体涉及一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法。
技术介绍
甜瓜(CucumismeloL.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)一年蔓生的草本植物，是重要的园艺作物之一。由于甜瓜属作物的遗传基础狭窄，传统育种技术对新品种的培育受限于种内与种间杂交隔离，很多重要的性状无法通过常规育种方法进行改良。此外，传统育种技术耗时较长，效率较低。与之相比，转基因技术具有高效性、精准性等优点，且逐渐被用于农作物的品种改良中。然而，甜瓜的遗传转化技术尚不成熟，相关研究工作也进展缓慢。对现有专利文献检索发现，CN102080100A公开了一种农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，包括以甜瓜子叶或子叶节为外植体，将外植体浸入农杆菌菌液中浸泡，随后在培养基中诱导、培养芽，待芽长到高1-3cm高时，在培养基中生根、移栽。该方法提高了甜瓜的转化效率，解决了甜瓜利用农杆菌转化的难度问题。然而，该方法在转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n1)构建带有BlpR基因的重组表达载体，转入农杆菌得到重组菌株；/n2)在发芽培养基中促进甜瓜种子发芽得到子叶；在无菌环境下，采用步骤1)获得的重组农杆菌侵染甜瓜子叶近轴端片段，将侵染后的子叶片段置于植物-农杆菌共培养培养基上生长，得到膨大的子叶外植体；/n3)将膨大的子叶外植体转移至分化筛选培养基上培养，诱导出丛生芽；/n4)将伸长的丛生芽分离成单株，进一步筛选培养，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；/n5)将具有甜瓜地上部分的幼苗转入生根培养基中，诱导根的分化，得到T0代甜瓜转基因幼苗；/n6)通过草铵膦试纸和PCR双重...

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)构建带有BlpR基因的重组表达载体，转入农杆菌得到重组菌株；
2)在发芽培养基中促进甜瓜种子发芽得到子叶；在无菌环境下，采用步骤1)获得的重组农杆菌侵染甜瓜子叶近轴端片段，将侵染后的子叶片段置于植物-农杆菌共培养培养基上生长，得到膨大的子叶外植体；
3)将膨大的子叶外植体转移至分化筛选培养基上培养，诱导出丛生芽；
4)将伸长的丛生芽分离成单株，进一步筛选培养，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；
5)将具有甜瓜地上部分的幼苗转入生根培养基中，诱导根的分化，得到T0代甜瓜转基因幼苗；
6)通过草铵膦试纸和PCR双重鉴定T0代甜瓜转基因幼苗，得到完成遗传转化的株系。


2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，步骤6)具体包括如下步骤：
6-1)用草铵膦喷洒步骤5)中的甜瓜幼苗，不枯死的幼苗即为遗传转化的植株，发生枯死的幼苗不为遗传转化植株；
和/或，6-2)将步骤5)中的甜瓜幼苗叶片用水磨碎，将草铵膦试纸条放入研磨液中，测试结果产生阳性目标条带的即为遗传转化的植株，无目标阳性条带的不为遗传转化植株；
和/或，6-3)提取步骤5)中的甜瓜幼苗叶片DNA，利用PCR扩增表达载体上的特异DNA序列，并测序；有条带且测序结果与载体序列一致的为遗传转化的植株；有条带但测序不正确，或没用扩增条带的不为遗传转化植株。


3.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，
步骤2)中，用于侵染的重组农杆菌先后经LB、B5液体培养基培养至菌液OD值为0.4-0.6。


4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，用于侵染的重组农杆菌先在含50-150mg/L利福平和50-150mg/L壮观霉素的LB液体培养基过夜培养，再吸取该过夜培养得到的侵染液0.5-5mL，加入100-150mLB5液体培养基中，再加入40-80ul400mM的乙酰丁香酮，再次过夜培养至菌液OD值为0.4-0...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丹枫，刘斌，杨森，牛庆良，张屹东，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31