【技术实现步骤摘要】
一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法
本专利技术涉及一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白用于自养和兼养培养的方法，属生物工程
技术介绍
海洋微藻在海洋生态系统中具有重要的作用，作为初级生产者，它们是海洋生物的重要食物来源。海洋微藻种类繁多，其中三角褐指藻由于其生长速率快，油脂含量高等特点被人们所关注。其生长速率可达到0.38g/L/d，收获后油脂含量能达到48％以上，EPA(二十五碳烯酸)产率可达到36mg/L/d，近年来作为新的EPA生产来源。并且作为典型的硅藻，其岩藻黄质含量在15.42～16.51mg/g之间。但藻细胞在生长过程中，易受到高光胁迫，产生过量活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)，造成细胞氧损伤，导致细胞生长速率降低，并影响不饱和脂肪酸的积累。因此，利用基因工程手段对野生型微藻进行改造，提高其抗逆性，对改善三角褐指藻生长，提高岩藻黄质和EPA产量具有重要意义。微藻的营养方式具有多样性，大多数微藻采用光合自养(Phetoautotr...
【技术保护点】
1.一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白转基因藻株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)VHb基因密码子优化及表达载体的构建/n本专利技术对原VHb基因如SEQ ID NO.1所示，进行藻类偏好性密码子优化，优化后的VHb基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示；以pPha-T1为基础表达载体，在fcp-A启动子下游插入VHb基因，构建VHb表达载体，即质粒pPha-fcp-VHb；/n(2)转化株的制备/n将步骤(1)构建的表达载体利用PCR扩增线性化片段，通过电转化的方式导入细胞内，筛选获得表达透...
【技术特征摘要】
1.一种在三角褐指藻中表达透明颤菌血红蛋白转基因藻株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)VHb基因密码子优化及表达载体的构建
本发明对原VHb基因如SEQIDNO.1所示，进行藻类偏好性密码子优化，优化后的VHb基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQIDNO.3所示；以pPha-T1为基础表达载体，在fcp-A启动子下游插入VHb基因，构建VHb表达载体，即质粒pPha-fcp-VHb；
(2)转化株的制备
将步骤(1)构建的表达载体利用PCR扩增线性化片段，通过电转化的方式导入细胞内，筛选获得表达透明颤菌血红蛋白的转基因藻株。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中将质粒pPha-T1作为模板，利用引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，PCR扩增构建载体所需的骨架片段；以含有VHb基因片段的质粒载体为模板，利用引物SEQIDNO.6和SEQIDNO.7扩增VHb基因片段。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述PCR反应体系如下：
DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×pfumix12.5μL，ddH2O9.5μL；
优选的，PCR反应条件如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，(引物Tm值-5℃)退火30s，72℃延伸2000bp/min，重复35个循环；72℃延伸10min；
优选的，基于VHb片段与载体骨架之间的重叠区域，用无缝连接酶试剂盒进行连接，构建质粒pPha-fcp-VHb。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中利用引物SEQIDNO.8和SEQIDNO.11扩增共表达VHb基因与抗性基因的线性片段，用于电转化获取单拷贝转化株。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将宿主藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓缩收集(3～5)×108个细胞；用375mM的山梨醇洗3～5次后，向藻液中加入3～5μgVHb基因与抗性基因的线性片段，混匀后置于冰上反应10～60分钟；将反应后的藻液加入电转杯中，在2200～3600V，600～1000Ω，50～100μF条件下进行电击；电击后的藻液立即转移至10mL新鲜的f/2培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：范勇，丁晓婷，李福利，姜尔颖，师晓艺，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。