陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统技术方案

本发明专利技术公开了陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，涉及基因工程技术领域。能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该载体通过下列步骤制备获得：获得目的序列TadA‑TadA7.10‑2linker，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，利用Ale Ⅰ和Pac Ⅰ对SEQ ID NO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA‑TadA7.10‑2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本发明专利技术在棉花中的编辑效率达64.86％，本发明专利技术在棉花中有较高的特异性，该方法显示出较高的编辑效率和很高的实用性，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统
本专利技术涉及基因工程
，具体为陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统。
技术介绍
用RNA指导的基因编辑技术CRISPR/Cas9自诞生以来掀起一场生物技术革命，在基因敲除、敲入、碱基修复等领域得到了广泛的应用1。与其他基因工程工具相比，这种技术更容易使用，并且更有效，因此，在其发现后的短短几年内，就已经被应用于世界各地的实验室，CRISPR/Cas9基因编辑系统由一个具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白(或其他同源蛋白)和一条单链向导RNA(singleguide,sgRNA)组成。sgRNA与Cas9蛋白结合靶向到基因组特定位点，Cas9切割产生双链断裂(doublestrandbreaks,DSB)，经过细胞自主性的非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)或同源重组(homology-directedrepair,HR)进行修复，引入突变，NHEJ是一种错配的修复机制，DNA连接时产生碱基插入或缺失突变。HR是指有同源臂供体存在的情况下，供体中的外源基因片段通过同源重组整合到靶位点，利用这一方法可以实现基因的原位矫正和遗传增强，已有研究表明，在细胞分裂的各个时期中，细胞自主发生NHEJ的频率高于HR，CRISPR/Cas9系统切割靶标位点后启动的HR介导的DNA修复在植物基因组编辑中非常低效，而且DNA修复模板如何高效地在编辑细胞中的的递送也是一个挑战，极大地限制了传统CRISPR/Cas9在高分辨率单碱基编辑中的应用。基于传统CRISPR/Cas9发展起来的单碱基编辑器(baseeditor,BE)的出现则克服了这些弊端,其中,胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditor,CBE)能够使C·G转换为T·A,腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditor,ABE)能够使A·T转换为G·C,都可以在不引入双链断裂的情况下实现高效的单碱基置换,这就避免了传统的CRISPR/Cas9在进行非同源末端连接(nonhomologousend-joining,NHEJ)时引入不可控的插入或缺失突变(Indels)。单碱基编辑技术基于无核酸酶活性的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶(nCas9)、胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶以及sgRNA形成的复合体，dCas9或nCas9没有切割DNA双链的核酸内切酶活性，但保留了DNA结合活性,在不断裂DNA双链和提供DNA模板的情况下，sgRNA通过与靶位点互补配对，引导融合脱氨酶蛋白中dCas9或nCas9结合到靶位点直接对靶向位点进行精准编辑，实现了在一定的活性窗口内胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)到腺嘌呤(A)的单碱基转换。单碱基编辑技术的出现促进了点突变基因编辑的有效性和使用范围。目前，单碱基编辑系统在很多物种中被报道，但在异源四倍体的棉花中只报道了胞嘧啶单碱基编辑，棉花是重要的经济作物，棉花纤维是纺织工业重要的天然纤维，棉籽油也是重要的油料储备，仅有CBE单碱基编辑系统是不够的，还需要开发新的可行而又有效的定点编辑工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良和新品种选育提供重要技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于实现陆地棉基因组中精准高效的编辑，特别是构建一种适用于陆地棉的腺嘌呤单碱基编辑方法，本专利技术基于GhBE311载体，构建了融合Cas9缺口酶(nCas9)，腺嘌呤脱氨酶(7.10Tad)适用于棉花遗传转化方法的单碱基编辑方法(即载体GhABE7.10n)。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，该载体通过下列步骤制备获得：S1、获得目的序列TadA-TadA7.10-2linker，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：4所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：1)在如序列表SEQIDNO：3所示的序列TadA-TadA7.10-2linker在棉花中进行密码子优化；2)优化后的序列如序列表SEQIDNO：4，根据序列进行核苷酸合成；S2、利用AleⅠ和PacⅠ对SEQIDNO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA-TadA7.10-2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQIDNO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。进一步优化本技术方案，所述的载体GhABE7.10n在陆地棉基因组编辑中的应用。进一步优化本技术方案，所述步骤S1中，阅读文章ProgrammablebaseeditingofA·TtoG·CingenomicDNAwithoutDNAcleavage，从中获取7.10TadA+2linker氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3所示。进一步优化本技术方案，所述步骤S2中，使用M1UI/XbaI对GhBE3载体，其核苷酸序列序列表SEQIDNO：1所示，进行双酶切切除片段UGI后再连接一个核定位信号NLS，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：5所示，再使用使用PacI/AleI双酶切切除片段rAPOBEC1-XTEN,公司再把切除载体上多余的序列再与步骤S1中优化后的7.10TadA+2linker目的序列一起合成连接，得到适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。与现有技术相比，本专利技术提供了陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，具备以下有益效果：1、该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本专利技术在棉花中的编辑效率达64.86％。2、该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本专利技术在靶标序列上的编辑位点为A5(PAM远端开始计算)。3、该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本专利技术在棉花中有较高的特异性。附图说明图1是对载体GhBE3改造的路线图。图2是本专利技术的表达载体GhABE7.10n的构建图。图3是对载体GhBE3切除UGI连接NLS片段后的电泳图，附图标记说明：泳道1,2,3是NLS+片段前后载体各150bp左右,泳道M是5K的marker。图4是拼接后GhABE7.10n的电泳图，附图标记说明：泳道1是GhABE7.10n构建完成检测，泳道2是双酶切切除rAPOBEC1-XTEN的GhBE3检测图，泳道M是5K的marker。图5是本专利技术sgRNA连接到GhABE7.10n的电泳图，附图标记说明：泳道1,2是目的片段连接到GhABE7.10n载体,泳道M是5K的marker。图6为本专利技术GhPEBP的遗传转化图，附图标记说明：图6中的罗马字编号分别是：Ⅰ.无菌苗培养阶段；Ⅱ.共培养阶段；Ⅲ.选择培养阶段；Ⅳ.愈伤培养阶段；Ⅴ.分化培养阶段；Ⅵ-VII.生根培养；VIII.营养液培养；Ⅸ-X.转基因植株在温室生长。图7是本专利技术的GhPEBP和G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：/nS1、获得目的序列TadA-TadA7.10-2linker，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：/n1)在如序列表SEQ ID NO：3所示的序列TadA-TadA7.10-2linker在棉花中进行密码子优化；/n2)优化后的序列如序列表SEQ ID NO：4，根据序列进行核苷酸合成；/nS2、利用AleⅠ和PacⅠ对SEQ ID NO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA-TadA7.10-2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。/n

【技术特征摘要】
1.陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：
S1、获得目的序列TadA-TadA7.10-2linker，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：4所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
1)在如序列表SEQIDNO：3所示的序列TadA-TadA7.10-2linker在棉花中进行密码子优化；
2)优化后的序列如序列表SEQIDNO：4，根据序列进行核苷酸合成；
S2、利用AleⅠ和PacⅠ对SEQIDNO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA-TadA7.10-2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQIDNO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。


2.根据权利要求1所述的陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，其特征在于，所述的载体GhAB...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，王冠英，许忠平，王福秋，孙琳，李波，王琼琼，斯欢，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42