增加细胞中感兴趣的核酸分子表达水平的方法技术

本发明专利技术提供通过启动子激活核酸序列增加细胞，优选植物细胞，中感兴趣的核酸分子表达水平的方法，所述启动子激活核酸序列能在位点特异性引入控制感兴趣的核酸分子表达的受体启动子后，增加细胞或生物体中的感兴趣的核酸分子表达。本发明专利技术还提供鉴定这类启动子激活元件的方法以及将其引入生物体或细胞以特异性增加感兴趣的核酸分子表达的方法。此外，本发明专利技术还涉及启动子激活元件在增加感兴趣的核酸分子表达中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增加细胞中感兴趣的核酸分子表达水平的方法
本专利技术涉及新的启动子激活元件。这些短核酸序列能够在位点特异性引入控制感兴趣的核酸分子表达的受体启动子后，增加细胞或生物体中感兴趣的核酸分子表达。采用此新技术能使内源或外源核酸分子表达增加到多至未引入激活元件时启动子控制下所达到的许多倍。本专利技术还提供鉴定这类启动子激活元件的方法以及将其引入生物体或细胞以特异性增加感兴趣的核酸分子表达的方法。此外，本专利技术还涉及启动子激活元件在增加感兴趣的核酸分子表达中的应用。专利技术背景许多基因在生物体中的表达水平取决于不同因素，如发育阶段或生理和环境条件。一个基因的表达能在某些情况下诱导且如果情况变化则完全关闭。基因表达、基因转录的起始点由一定范围的不同机制调节，其通常涉及携带转录起始位点(TSS)的启动子区域。一些启动子在所有情况下有活性(组成型启动子)，其他则受到严格调节并仅相应某些刺激。转录因子结合特异DNA序列并激活或阻遏转录(反式作用因子)。因此，启动子序列携带若干反式作用因子结合位点，称为顺式调节元件，但启动子中发现的一些序列延伸段(stret本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增加细胞，优选植物细胞，中感兴趣的核酸分子表达水平的方法，所述方法包括：/nia)向细胞引入启动子激活核酸序列、嵌合启动子、递送系统或者核酸构建体或表达盒，或/nib)向细胞引入用于位点特异性修饰控制感兴趣的核酸分子表达的受体启动子的核酸序列的装置，和/nii)任选地，向细胞引入位点特异性核酸酶或其活性片段，或提供编码其的序列，所述位点特异性核酸酶诱导预定位置的双链断裂，优选地，其中所述位点特异性核酸酶或其活性片段包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas系统，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/C2C2系统、CRISPR/C...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180326 EP 18164080.61.一种增加细胞，优选植物细胞，中感兴趣的核酸分子表达水平的方法，所述方法包括：
ia)向细胞引入启动子激活核酸序列、嵌合启动子、递送系统或者核酸构建体或表达盒，或
ib)向细胞引入用于位点特异性修饰控制感兴趣的核酸分子表达的受体启动子的核酸序列的装置，和
ii)任选地，向细胞引入位点特异性核酸酶或其活性片段，或提供编码其的序列，所述位点特异性核酸酶诱导预定位置的双链断裂，优选地，其中所述位点特异性核酸酶或其活性片段包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas系统，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/C2C2系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cmr系统，工程化的归位内切酶、重组酶、转座酶和大范围核酸酶和/或其任何组合、变体或催化活性片段；以及任选地，当所述位点特异性核酸酶或其活性片段是CRISPR核酸酶时：提供至少一种向导RNA或至少一种向导RNA系统，或编码其的核酸；和
iiia)在控制感兴趣的核酸分子表达的受体启动子转录起始位点上游或下游位置向控制细胞中的感兴趣的核酸分子表达的受体启动子插入启动子激活核酸序列，或
iiib)在控制感兴趣的核酸分子表达的受体启动子转录起始位点上游或下游位置通过添加和/或缺失和/或取代修饰控制细胞中感兴趣的核酸分子表达的受体启动子序列，从而形成启动子激活核酸序列，和
iiic)任选地，通过添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸修饰步骤iiia)或iiib)中所插入或引入的启动子激活核酸序列中存在的或受体启动子中存在的一个或多个TATA盒基序，使得当将一个或多个经修饰TATA盒基序与TATA盒共有序列匹配或比对时，所述一个或多个TATA盒基序转变成相对分增加或更高的一个或多个TATA盒基序；
其中在步骤iiia)或iiib)中向受体启动子引入启动子激活核酸序列的插入或修饰在以下位置
(a)感兴趣的核酸分子转录起始位点上游的500个核苷酸或更少，优选150个核苷酸或更少；和/或
(b)感兴趣的核酸分子起始密码子上游的多于50个核苷酸；和/或
(c)其中插入或引入位点下游没有上游开放阅读框(uORF)，
其中所述启动子激活核酸序列配置成用于靶向位点特异性插入控制细胞或生物体中感兴趣的核酸分子表达的受体启动子，其中所述启动子激活核酸序列在位点特异性插入后引起所述感兴趣的核酸分子表达增加，优选地，其中感兴趣的核酸分子对受体启动子而言是异源或天然的和/或对细胞或生物体而言是内源或外源核酸分子，和
其中所述启动子激活核酸序列包含
i.分离自供体启动子的一个或多个连续核苷酸延伸段，其中所述供体启动子是具有高表达水平的基因的启动子，和/或
ii.供体启动子的一个或多个TATA盒基序，或者当将一个或多个TATA盒基序与TATA盒共有序列匹配或比对时，相对分大于0.8的一个或多个TATA盒基序，和/或
iii.包含供体启动子的一个或多个嘧啶斑(Y斑)启动子元件，
其中所述嵌合启动子包含受体启动子或其核心启动子，和在受体启动子转录起始位点上游或下游位置的至少一种启动子激活核酸，
其中所述递送系统包含所述启动子激活核酸序列和/或所述嵌合启动子，和/或用于向受体启动子位点特异性插入或引入启动子激活核酸序列的装置，
其中所述核酸构建体或表达盒包含所述启动子激活核酸序列和/或所述嵌合启动子。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述启动子激活核酸序列的长度为6-70个核苷酸，优选7-60个核苷酸，更优选8-40个核苷酸且最优选9-20个核苷酸。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞或生物体是植物细胞或植物，和/或其中所述受体启动子和/或供体启动子是植物启动子，和/或其中所述受体启动子和供体启动子不同和/或源自同一物种或不同物种。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中位点特异性插入受体启动子后，相较于无插入的受体启动子控制下的感兴趣的核酸分子表达水平，所述感兴趣的核酸分子表达水平增加至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，优选至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍，更优选至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍或至少20倍，甚至更优选至少25倍、至少30倍、至少35倍或至少40倍且最优选大于40倍。


5.一种嵌合启动子，包含受体启动子或其核心启动子以及在受体启动子转录起始位置上游或下游位置的至少一种权利要求1-4中任一项所定义的启动子激活核酸序列。


6.一种递送系统，包含权利要求1-4中任一项所定义的启动子激活核酸序列和/或权利要求5所述的嵌合启动子，和/或用于向受体启动子位点特异性插入或引入启动子激活核酸序列的装置。


7.一种核酸构建体或表达盒，包含权利要求1-4中任一项所定义的启动子激活核酸序列和/或权利要求5所述的嵌合启动子。


8.一种载体，包含权利要求1-4中任一项所定义的启动子激活核酸序列，权利要求5所述的嵌合启动子或者权利要求7所述的核酸构建体或表达盒，或用于向受体启动子位点特异性引入所述启动子激活核酸序列、嵌合启...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·施特赖内尔，F·韦尔特迈尔，
申请(专利权)人：科沃施种子欧洲股份两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE