一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用制造技术

本发明专利技术属于基因合成技术领域，公开了一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用，抗坏血酸合成的基因DNA序列为SEQ ID NO：1；本发明专利技术还提供一种利用所述促进番茄抗坏血酸合成的基因构建的表达载体，促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因在鉴定MIOX功能上的具有实际的应用意义。本发明专利技术从遗传转化方面证明肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能；通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性；通过调控抗坏血酸生成量是提高植物抗逆性的又一条可行途径，在植物抗逆育种中将会发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用
本专利技术属于基因合成
，尤其涉及一种促进番茄抗坏血酸合成的基因及应用。
技术介绍
目前，AsA在生物体中具有重要的抗氧化作用和代谢功能。在植物中，AsA与植物的抗逆性有关。一般，提高植物体内的AsA含量，能增强植物耐寒冷、高温、干旱和盐碱等逆境的能力。在动物中，AsA是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质。AsA能防治坏血病；可以促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血；具有抗氧化作用，能阻断致癌物亚硝胺的生成，阻止癌细胞扩散，降低外来致癌物在体内的活性，从而起到防治癌症的作用；能够改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病；具有抗衰老作用，维生素A、E及维生素C的共同作用，可促进皮下组织代谢，改善皮肤供血状况，防止皮肤过早出现皱褶；还可以增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。但是，人类和其他一些哺乳动物自身已经丧失了合成能力(Chatterjee,1973；VictorianoandMiguel,2004)，必须从食物中摄取，新鲜水果和蔬菜富含抗坏血酸。早在1933年就鉴定出AsA的分子结构，目前人们提出了AsA生物合成的三条途径：甘露糖/L-半乳糖途径(Wheeleretal.,1998)、半乳糖醛酸途径(Agiusetal.,2003)、古洛糖途径(WoluckaandMontagu,2003)。MIOX不含有亚铁原子，催化四个电子只氧化一个电子到产物D-葡萄糖醛酸。拟南芥基因组测序计划的完成使得研究者能够在植物中找到与猪肌醇氧酶基因同源的序列。经过搜索，在拟南芥第1、2、4、5染色体上找到4个与这个基因同源的开放阅读框。2007年王海光等研究了水稻肌醇加氧酶基因，实时定量PCR表明水分胁迫下OsMIOX基因上调表达，且在旱稻中的表达量显著高于水稻。认为水稻肌醇加氧酶基因在植物水分胁迫中起着分子应答的作用，并且推测ABA可能诱导OsMIOX的表达(王海光，2007)。2008年Endres超量表达MIOX，使其酶活性提高了30多倍，并且超量表达MIOX后，MI总是处于量很少的状态，饲喂MI实验也表明超量表达MIOX比对照积聚更少的MI，原因就是超量表达MIOX提高了MIOX酶活性。由于肌醇是抗坏血酸合成的底物，MIOX是否对抗坏血酸合成具有促进作用有待进一步研究。番茄(Solanumlycopersicon.)系茄科番茄属一年生或多年生草本植物，起源于南美洲秘鲁、厄瓜多尔、玻利维亚等地，是一种高营养、高价值、风味较好的食用作物，也是世界上主栽蔬菜之一。番茄中含有丰富的柠檬酸、苹果酸，所以呈酸性环境，而AsA有较强的还原性，性质不稳定，易被空气中的氧气氧化，极易受温度、pH值、光等因素的影响，在碱性条件下易破坏，在酸性条件下较稳定。故在同样条件下，番茄中AsA的保存率比其它蔬菜要高许多(冯彦博，2002)。目前所研究的大部分番茄品种AsA含量在10-30mg/100g。鉴于抗坏血酸在生物体中的重要功能，亟需要明确MIOX在抗坏血酸生物合成中的作用，本专利鉴定番茄MIOX基因在抗坏血酸生物合成中的功能。综上所述，现有技术存在的问题是：番茄中抗坏血酸生物合成是由多基因控制的，MIOX是否参与抗坏血酸的合成？MIOX在其他植物物种中的作用功能并不一致，在番茄中的具体功能是什么？番茄中抗坏血酸生物合成是否存在肌醇途径？这些都是未知的问题。现有技术还不能明确抗坏血酸肌醇合成途径，缺乏合成酶基因MIOX、并鉴定该基因在抗坏血酸生物合成中功能的方法。解决上述技术问题的难度：番茄抗坏血酸合成代谢受多基因位点控制，属于数量性状，且不同栽培环境影响抗坏血酸合成积累，测定条件影响抗坏血酸测定准确度，因此抗坏血酸合成代谢研究存在一定的技术难度。另一方面，甘露糖半乳糖途径被认为是抗坏血酸合成的主效途径，MIOX基因是否参与抗坏血酸合成代谢调控，以及该基因参与调控的效应可能低于主效途径，一定程度上增加了本专利的技术难度。解决上述技术问题的意义：番茄果实中AsA含量高，且由于在人类饮食中番茄是常见的蔬果，提高番茄抗坏血酸含量有重要的意义。人类由于确实抗坏血酸合成的能力，必须从新鲜水果蔬菜中摄取抗坏血酸。随着人们生活水平地提高，人们更加重视水果蔬菜中的营养价值，如维生素C等含量。番茄中调控抗坏血酸积累的机理研究处于起步阶段。因此，全面了解抗坏血酸的生物合成途径及相关的调控过程，进而更有效地提高番茄中抗坏血酸的水平，对于加深植物抗坏血酸合成基础科学问题的认识和提高人们营养健康水平都具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因及应用。本专利技术是这样实现的，一种促进番茄抗坏血酸合成的基因，该基因为MIOX基因；所述促进番茄抗坏血酸合成的MIOX基因DNA序列为SEQIDNO：1。GAGAAAATGACTATTCTCATTGAGCAGCCTGAATTTGGATCACAAGTGGAGGAGAAAAAAGTCTCATTCAATGCCAATGAACTTATTTTGGATGGTGGATTTATGGTACCAAAGACATTGTCTTCTCAAGATGAAATATTTGAAGTGCCAGACATAAATGCATTTGGTCAATCATTTAGGGATTATAATGTAGAAAGTGAGAGACAAAAATCAGTGGAAGAATTTTATAGGGTTCAACACATTAATCAAACATATGACTATGTGAAAAAAATGAGAAAAGAATATGGAAAATTGAACAAAATTGAAATGAGTATTTGGGATTGTTGTGAACTTTTGAATGATGTAGTTGATGATAGTGATCCTGATTTGGATGAACCACAAATTGAGCATTTGTTACAAACTGCTGAAGCTATTAGAAAAGATTATCCAAATGAAGATTGGCTTCATTTGACCGGCCTCATTCACGACCTAGGTAAAGTACTTCTTCATCCAAGTTTTGGAGGGCTTCCTCAATGGGCTGTTGTTGGAGACACATTTCCTCTTGGTTGTGCTTTTGATGAATCAATTGTTCACCACAAGTATTTTAAGGAAAATCCAGACATCAACAACAATATTTATAATACAAAAAATGGTGTATATGAAGAAGGTTGTGGACTTGACAAAGTTGTTATGTCATGGGGACATGATGATTATATGTATTTAATTGCAAAGGAAAATAAAACTACTCTTCCTTCTGCTGCTTTATTTGTCATACGTTACCACTCTTTCTATGCATTACATAGATCAGGAGCATATACACACTTGATGAATGAGGAGGACAAAGAGAACATGAAGTGGCTCAACATTTTTAATAAATATGATTTATATAGCAAGAGTAAAGTTCGAATTGATGTGGAAAAAGTCAAGCCATACTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进番茄抗坏血酸合成的基因，其特征在于，所述促进番茄抗坏血酸合成的基因DNA序列为SEQ ID NO：1。/n

【技术特征摘要】
1.一种促进番茄抗坏血酸合成的基因，其特征在于，所述促进番茄抗坏血酸合成的基因DNA序列为SEQIDNO：1。


2.一种利用权利要求1所述促进番茄抗坏血酸合成的基因构建的表达载体。


3.一种如权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括：
第一步，利用Primer5设计全长基因引物，在PCR仪中以番茄AC的cDNA为模板扩增获得目的片段；将PCR产物链接到pEASY-B载体(北京全式金公司产品)上，连接产物热激法转化大肠杆菌，50mg/LKm抗性平板筛选阳性克隆，挑选阳性克隆，在37℃摇床上以200r/min震荡培养过夜，用基因特异性引物经PCR检测后挑选阳性克隆测序验证；
第二步，挑选克隆进行测序，选择正确的克隆摇菌抽提质粒；Xbal和KpnI双酶切重组质粒1.5h；
第三步，切胶利用胶回收试剂盒回收得到目的片段，利用T4连接酶将目的片段连接到用Xbal和KpnI双酶切后的pMV2载体上；连接产物热激法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，用35S结合基因反向特异性引物对单克隆进行PCR阳性检测，挑取阳性克隆摇菌提质粒，双酶切验证正确后通过电击法转入农杆菌感受态C58细胞中；
第四步，挑选阳性克隆，在28℃摇床上以150r/min震荡培养过夜，利用载体上35S加基因反向特异性引物同样对菌液进行PCR阳性检测；阳性克隆加甘油后混匀保存在-70℃低温冰箱。


4.一种如权利要求1所述促进番茄抗坏血酸合成的基因在鉴定MIOX功能上的应用，其特征在于，所述应用方法包括：
以番茄为材料，用农杆菌介导转化法将MIOX超量表达载体导入番茄植株中，从遗传转化方面证明古洛糖途径和肌醇途径，并初步鉴定MIOX的功能；通过调控抗坏血酸生物合成相关酶基因的表达，改变相关酶的活性，调控植物体内AsA含量，增加植物对氧逆境的抗性；
并进行转基因番茄植株AsA含量的测定、测定MI对SlMIOX酶活性的影响、逆境下基因表达量分析、抗氧化胁迫能力检测。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转基因番茄植株AsA含量的测定方法包括：
步骤一，在每一株番茄的同一部位取6-8片叶片，液氮速冻，用液氮磨成粉末，并称取质量，分成三份(叶片每份0.2g左右，果实每份1g左右)，用0.1％的偏磷酸提取；
步骤二，样品混合物10000r/min离心10min，上清液通过微孔滤膜过滤，上样100ul测定AsA含量，加入等体积DTT室温反应15min，测定总AsA的含量，每份样品测三次；
步骤三，采用SB-AqC18柱，流动相使用pH值为4.5，0.2mol.l-1的乙酸缓冲液，流速为1.0ml.min-1，测定波长为254nm；
步骤四，利用AsA标样制作标准曲线。


6.如权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张余洋，郑伟，叶志彪，李汉霞，叶杰，张俊红，张廷艳，
申请(专利权)人：武汉楚为生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42