3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用制造技术

本发明专利技术提供了3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶及其基因序列和应用。一种用于表达3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶的基因序列，基因序列为SEQ ID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。本发明专利技术的3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶能够高效催化雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(4‑AD)反应生成雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)，具有高酶活性。另外，本发明专利技术获得了可溶性的3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶，增加了酶的溶解度。

【技术实现步骤摘要】
3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用
本专利技术涉及生化领域，具体地，涉及3-甾酮-1,2-脱氢酶及其基因序列和应用。
技术介绍
当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的C1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物C1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。传统的方法是应用化学法进行C1,2脱氢。尽管化学方法已用于Δ1-脱氢，将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1,2-位时，醋酸泼尼松龙(PA)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于类固醇结构的复杂性，传统的化学方法难以专一修饰甾体中间体，反应产率为80％左右，反应专一性低，副产物多，环境污染等缺陷，而且底物与产物往往结构相似不易分离等问题，使得高端甾体药物工业生产化受到限制。从4-AD转化而来的ADD是合成类固醇药物的重要前体，例如避孕药、雌激素和孕激素。利用4-AD制备ADD就一直是甾体医药行业的关键技术。高效酶法工艺制备甾体中间体，与激素药物的多步化学合成相比，效率高，产物纯度高。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。利用3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD)进行酶促反应制备ADD和其它C1,2-脱氢甾体药物具有重大的应用前景。KsdD作为甾醇转化过程中的关键酶，对整个甾醇转化过程都起着很重要的作用。KsdD是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1,2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。如下所示，KsdD催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1，4-雄烯二酮(ADD)。KsdD酶已经在很多降解甾醇的细菌中被发现，如简单节杆菌、紫红红球菌、睾丸酮假单胞菌、珊瑚诺卡氏菌、耻垢分支杆菌。由于不同来源KsdD酶，他们它们的氨基酸序列不同，蛋白酶构象存在差异性，导致底物的专一性也不同。近年来，利用基因工程系统表达3-甾酮-1,2-脱氢酶是其工艺用的难点之一，KsdD酶属于细胞膜结合蛋白，在细胞质中溶解度低。虽然KsdD在许多外源菌株如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)等细菌中异源表达均有报道，但是表达量都较低，得不到有活性的纯酶。Pseudomonastestosterone的KsdD基因通过质粒pRG1在大肠杆菌中的表达，表达的蛋白仅有3.3％是可溶的，其余的都是以包涵体的形式存在。Arthrobactersimplex的KsdD基因通过大肠杆菌-链霉菌的穿梭质粒，在Streptomyceslividans中表达，在添加和不添加底物4-AD的情况下，酶活力提高了100倍。通过pDEX-3质粒将Rhodococcusrhodochrous的基因KsdD在大肠杆菌中表达，转化细胞表达出可溶性的KsdD，且表达量是出发菌株的30倍。将Rhodococcuserythropolis的基因KsdD通过pSDH305质粒和pET3b质粒实现了该基因在大肠杆菌中的表达，酶活分别为1.38U/mg和6.0U/mg。将Arthrobactersimplex的KsdD基因通过载体pWB980在枯草芽孢杆菌WB600中表达，胞内外酶活分别为110mU/mg和15mU/mg，约为出发菌的30倍，以4-AD为底物，转化40h达到最大转化率为45.5％。将Arthrobactersimplex的KsdD基因克隆到质粒pET22b和pET32a在E.coliBL21中的异源表达，酶活分别为35.29mU/mg和25.67mU/mg。将分枝杆菌NWIB-01的KsdD通过pUC18在E.coliDH5α中表达，酶活达21mU/mg。但这些酶活力较低。相比之下，重组大肠杆菌培养相对较容易，培养时间较短等优势。获得得高活性的KsdD酶，高效的利用酶催化反应来生产C1,2-脱氢甾体类化合物，这将会在很大程度上提高甾体类化合物的生产效率，并且能够定向的生产某种甾体类化合物，降低成本，提高回收效率，减轻对环境的危害。因此，本专利技术不仅在3-甾酮-1,2-脱氢酶的规模化生产中具有实践意义，同时，对于重组蛋白类产品生产工艺的放大研究也具有重要的理论意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。本专利技术还提供了一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQID.5，所述基因序列用于在酵母菌中表达。本专利技术还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体包括上述任一种基因序列。本专利技术还提供了上述表达载体表达得到的3-甾酮-1,2-脱氢酶。在上述3-甾酮-1,2-脱氢酶中，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的N端或C端结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。本专利技术还提供了3-甾酮-1,2-脱氢酶在制备1,4-雄烯二酮中的应用。本专利技术获得了可以在大肠杆菌或酵母菌中高效表达的3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列。本专利技术的3-甾酮-1,2-脱氢酶能够高效催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)反应生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，具有高酶活性。另外，本专利技术获得了可溶性的3-甾酮-1,2-脱氢酶，增加了酶的溶解度。附图说明图1示出了琼脂糖胶分析PCR扩增KsdD211基因产物，从右到左依次为温度梯度50℃、52℃、54℃、56℃、60℃。图2示出了琼脂糖凝胶图分析pRSV-KsdD211/DH5a菌落PCR，其中1#、3#、5#、7#、8#有目的条带，从中选取3#、7#摇菌测序。图3示出了KstD211氨基酸序列与其它KstD酶的比较。DSM1381:Mycobacteriumsp.DSM1381；MC2155:Mycobacteriumsp.MC2155；A.simplex:Arthrobactersimplex和SQ1:RhodococcuserythropolisSQ1。图4示出了KsdD725蛋白表达。其中CtrS为对照组上清，CtrP为对照组沉淀，同理后面的泳道分别为1#、2#、3#、4#样品的上清(S)和沉淀(P)。图5示出了pRSV-MBP-KsdD211蛋白表达条件筛选。(a)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQ ID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQID.4，所述基因序列用于在大肠杆菌中表达。


2.一种用于表达3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为SEQID.5，所述基因序列用于在酵母菌中表达。


3.一种表达载体，其中，所述表达载体包括根据权利要求1或2所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，成细瑶，宋士奎，周曦，
申请(专利权)人：武汉艾默佳华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42