制备C1,2-位脱氢甾体化合物的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备C1,2‑位脱氢甾体化合物的方法，包括：构建表达重组KstD酶的表达载体，其中，所述重组KstD酶的氨基酸序列为SEQ ID.3；利用所述表达载体和细胞培养的方式表达所述重组KstD酶，获得粗酶液；向所述粗酶液中加入底物雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(4‑AD)，反应得到C1,2‑位脱氢甾体化合物。本发明专利技术通过对分枝杆菌HGMS2的KstD211酶进行改造，获得一种可溶性KstD融合酶；通过利用重组大肠杆菌高效表达的KstD融合酶，采用高密度发酵制备融合KstD融合酶，酶比活达到31.6U/mg。

【技术实现步骤摘要】
制备C1,2-位脱氢甾体化合物的方法
本专利技术涉及生化领域，具体地，涉及制备C1,2-位脱氢甾体化合物的方法。
技术介绍
甾体激素药物是临床上一类重要的药物，其抗炎活性尤为显著，甾体药物被广泛用于预防和治疗各种疾病。此外，甾体母核结构的变化可导致更有效的类固醇药物。例如，当通过Δ1-脱氢将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1,2-位时，产物醋酸泼尼松龙(PA)的抗炎活性提高三到四倍。然而，由于甾体结构的复杂性，传统的化学方法难以专门修饰甾体中间体，化学方法存在转化率低，副产物多，环境污染等缺陷。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。如今，已证明酶转化技术是一种生产新型类固醇药物和活性药物成分的新型，高效且经济的方法。3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶(KstD)催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1,4-雄烯二酮(ADD)(图1)。从4-AD转化而来的ADD是合成高端甾体药物的重要前体，例如避孕药、雌激素和孕激素。尽管化学脱氢工艺已用于甾体制药行业，与激素合成的多步化学合成相比，酶法工艺效率高，不产生副产物积累，产物纯度高，因此，通过异源表达KstD，开发“绿色”高效酶促方法制备甾体中间体目前已开始引人关注。耻垢分枝杆菌mc2155的MsKstD1可以在3小时内以6g/L的浓度使氢化可的松的收率达到90％。新分枝杆菌DSM1381的KstD2可以使30g/L4-AD几乎完全转化。但是上述底物浓度低和低转化率限制了KstD酶工艺的工业化的应用。r>KstD酶促反应属于氧化还原反应，3-甾酮-1,2-脱氢酶(KstD)是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1,2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。工业化再生辅酶FAD的成本非常高，需要开发高效和低廉电子受体或者开放高效和低廉的辅酶再生系统，这是限制KstD酶工艺的工业化的应用的一个关键技术。KstD是诱导酶，也是一种膜蛋白。尽管对其进行异源表达的例子很多，但由于膜蛋白本身的难溶解性，多以包涵体的形式存在，是其工业化应用上亟待解决一个技术难题。不同微生物来源的KstD酶对甾体底物的专一性不同，因为不同KstD的蛋白氨基酸序列存在着差异性，决定它们的构象上在局部区域存在差异性，筛选或设计底物专一性的KstD酶，或者筛选一种多大多数底物通用的KstD酶也是甾体酶工艺工业化的关键需求技术。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种制备C1,2-位脱氢甾体化合物的方法，包括：构建表达重组KstD酶的表达载体，其中，所述重组KstD酶的氨基酸序列为SEQID.3；利用所述表达载体和细胞培养的方式表达所述重组KstD酶，获得粗酶液；向所述粗酶液中加入底物雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)，反应得到C1,2-位脱氢甾体化合物。在上述方法中，还包括：在反应之前，向所述粗酶液中加入电子受体甲萘醌，所述电子受体甲萘醌在反应液中的质量浓度小于等于1％。在上述方法中，还包括：在反应之前，向所述粗酶液中加入过氧化氢酶，过氧化氢酶在反应液中的浓度小于等于100U/L。在上述方法中，其中，所述重组KstD酶的N端或C端结合有麦芽糖结合蛋白(MBP)。本专利技术通过对分枝杆菌HGMS2的KstD211酶进行改造，获得一种重组KstD融合酶；通过利用重组大肠杆菌高效表达的KstD融合酶，采用高密度发酵制备融合KstD融合酶，酶比活达到31.6U/mg。在KstD211的N端-或C-融合MBP蛋白，形成可溶性MBP/KstD融合蛋白,增强KstD蛋白的溶解性，从而解决酶的溶解性问题。MBP可以放置在KstD的N-端或者C-端，均不改变KstD725活性。通过优化KstD融合酶反应电子受体种类和用量，对辅酶进行低成本高效再生循环，建立了融合酶转化雄烯二酮(4-AD)生成1，4-雄烯二酮(ADD)工艺。在本专利技术的摇瓶工艺中，以10g/L4-AD为原料，KstD融合酶转化4-AD，转化率在98％以上。通过放大并优化KstD融合酶催化体系，在15L反应釜中，以80g/L4-AD为原料，转化率在97％以上，精制后纯度可达99.5％以上。在15吨反应釜中，实现了4-AD到ADD的大规模的高效转化，底物浓度高达80～100gL-1,转化率达到98％，且产物单一，无其他杂质产生。本专利技术的酶法转化具有高效性、专一性、温和性等独特的优势。本专利技术的融合酶同样适用于高效转化生产其他具有高价值的甾体药物中间体。附图说明图1示出了3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶催化4-AD脱氢生成ADD。图2示出了SDS-PAGE分析比较可溶性KstD酶的表达。a)非融合KstD表达，1、2是诱导10h的上清和沉淀；3、4是诱导20h的上清和沉淀。b)融合蛋白表达MBP-KstD，5、6是诱导10h的上清和沉淀；7、8是诱导20h的上清和沉淀。图3示出了分批补料发酵重组大肠杆菌及诱导表达的过程曲线，▼--▼：OD600nm；★--★：溶氧；●--●：温度；◆--◆：pH；■--■：转速。图4示出了高密度发酵制备KstD酶。M：蛋白Marker；1:粗酶液上清-10h；2：粗酶液沉淀-10h；3：粗酶液上清-12h；4：粗酶液沉淀-12h；5：粗酶液上清-20h；6：粗酶液沉淀-20h。图5示出了C1,2-脱氢酶辅酶再生偶联系统的示意图。图6示出了不同辅酶再生系统对转化率的影响。图7示出了薄层色谱(TLC)分析重组KstD酶转化4-AD生成ADD反应。1:4-AD标品；2、3、4、5分别代表酶反应6h、12h、18h、24小时产物。图8示出了HPLC分析重组KstD酶转化4-AD生成ADD反应。a)4-AD表样；b)ADD标样；c)KstD催化反应液。具体实施方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。本申请对4-AD工业生产菌种分枝杆菌HGMS2进行了全基因组测序(GenbankID:CP031414.1)，从HGMS2菌种中鉴定出唯一的KstD酶基因，命名为KstD211(SEQIDNO.1)和氨基酸序列(SEQIDNO.2)。本专利技术对分枝杆菌HGMS2的KstD酶基因进行了克隆、表达、酶结构分析和改造。本专利技术构建了大肠杆菌的表达载体，把克隆出的KstD的基因通过pRSV表达载体后导入大肠杆菌,进行诱导表达，并表征了其酶特异性和选择性。前人的研究表明，重组KstD在大肠杆菌表达系统中的最高活性仅为6U/mg。通过比较KstD211与其他分枝杆菌KstD的氨基酸序列，本专利技术对KstD211进行序列改造，优化设计，获得高活力KstD725突变体。KstD725突变体氨基酸序列为SEQIDNO.3.编码KstD725突变体氨基酸序列的DNA序列经经过大肠杆菌偏爱密码子优化设计，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备C1,2-位脱氢甾体化合物的方法，包括：/n构建表达重组KstD酶的表达载体，其中，所述重组KstD酶的氨基酸序列为SEQ ID.3；/n利用所述表达载体和细胞培养的方式表达所述重组KstD酶，获得粗酶液；/n向所述粗酶液中加入底物雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)，反应得到C1,2-位脱氢甾体化合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备C1,2-位脱氢甾体化合物的方法，包括：
构建表达重组KstD酶的表达载体，其中，所述重组KstD酶的氨基酸序列为SEQID.3；
利用所述表达载体和细胞培养的方式表达所述重组KstD酶，获得粗酶液；
向所述粗酶液中加入底物雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)，反应得到C1,2-位脱氢甾体化合物。


2.根据权利要求1所述的方法，还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，成细瑶，宋士奎，周曦，
申请(专利权)人：武汉艾默佳华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42