一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术的遗传转化方法包括：外植体选择及预培养、农杆菌侵染、诱导培养形成组培苗等过程，利用本发明专利技术的遗传转化方法可在短时间内培育出大量优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，不仅可以缩短转化时间，提高遗传转化效率，而且转化体系稳定，不受时间和季节的影响，可以大批量的为华北地区培育生产具有抗蛀干害虫性能的优良黑杨品系。

【技术实现步骤摘要】
一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法。
技术介绍
杨树是世界上中纬度平原地区栽培面积最大的速生用材树种之一，具有生长快、产量高和易于更新的特点，也是对碳固定贡献最大的林木树种。从栽培面积上，我国杨树人工林面积已达700万公顷，位居世界首位。随着杨树造林面积的不断扩大，单一品系的过度利用导致杨树病虫害愈演愈烈。据统计，我国森林因病虫害年损失约1.4亿亩，直接经济损失达880亿元。尤其是，天牛等蛀干害虫，由于其幼虫在树干内隐蔽为害，世代长且不整齐，受环境影响小，天敌种类少，采用化学、物理、生物防治等手段难度较大，一旦发生为害，造成的损失惨重。因此，培育抗蛀干害虫杨树新品系是杨树产业化可持续发展亟待解决的重要问题。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种重要的杀虫微生物，具有高度特异的杀虫活性，不仅对人类和牲畜没有危害，且不污染环境。采用基因工程手段将Bt基因转入植物且在植物体中进行表达，从而赋予了转基因植物抗虫性。当前研究表明，对天牛等鞘翅目害虫具有特异杀虫活性的主要是Bt886Cry3A基因。但是，通过实验发现将Bt886Cry3A基因转化杨树后，对天牛的控制并没有达到预期的效果。因此，改造Bt886Cry3A同源基因，并在杨树中实现高效表达从而获得抗虫型窄冠黑杨成为控制天牛为害的关键。窄冠黑杨11号是由山东农业大学庞金宣、李际红等通过杂交选育出的杨树优良新品种，该新品种树冠窄，冠幅比一般大冠杨树小1/2-1/3，生长快、材质好，耐盐碱能力较强，是华北地区主栽杨树品系。目前还未见有通过将抗虫基因转入窄冠黑杨11号以提高其抗蛀干害虫能力的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法。采用本专利技术的方法，可以在短时间内培育出优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，提高了遗传转化效率，而且转化体系稳定，外源抗虫基因转入杨树之后，能够持续高表达抗虫毒蛋白，杀虫效果显著。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗。优选的，步骤(1)中，选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮，叶型平展的叶片。优选的，步骤(1)中，所述预培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA0.2mg/L-0.3mg/L和NAA0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基。优选的，步骤(1)中，暗培养的时间为24h。优选的，步骤(3)中，农杆菌侵染液的OD600在0.3-0.5之间，侵染时间为8-10min。优选的，步骤(3)中，所述窄冠黑杨11号叶盘分化培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA0.2mg/L-0.3mg/L和NAA0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基。优选的，步骤(3)中，所述一号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA0.2mg/L-0.3mg/L、NAA0.05mg/L-0.1mg/L、kan30mg/L-50mg/L和GA30.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基。优选的，步骤(4)中，所述二号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA0.2mg/L-0.3mg/L、NAA0.05mg/L-0.1mg/L、kan30mg/L-50mg/L、cef300mg/L-500mg/L、和GA30.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基。优选的，步骤(4)中，所述生根培养基为添加有25-30g/L、琼脂5-7g/L、NAA0.1mg/L-0.2mg/L、IBA0.1mg/L-0.2mg/L和活性炭0.5mg/L-1.0mg/L的1/2MS培养基。优选的，步骤(5)中，采用PCR和RT-PCR技术对生根的幼苗进行鉴定。本专利技术的有益效果：利用本专利技术的遗传转化方法可在短时间内培育出优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，不仅可以缩短转化时间，提高遗传转化效率(转化效率可达20％)，而且转化体系稳定，不受时间和季节的影响，可以大批量的为华北地区培育生产具有抗蛀干害虫性能的优良黑杨品系。附图说明图1：携带有杨树抗蛀干害虫基因(P2-Bt886Cry3Aa-P1)的重组质粒的结构示意图。图2：窄冠黑杨11号转抗虫基因实验流程图；其中，A为培养25天的生根苗，B为生根苗遗传转化中预培养阶段，C为生根苗遗传转化中共培养阶段，D为转基因植株生根培养基中长势，E为转基因植株移栽后情况。图3：窄冠黑杨11号转基因植株的PCR鉴定；其中，M：Marker2000；CK-：阴性对照；CK+：阳性对照；1-3：转基因植株。图4：窄冠黑杨11号转基因植株的RT-PCR鉴定结果柱状图；1-6分别是转基因植株。图5：天牛粪便(A)和中肠液(B)中毒蛋白含量的测定。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分所介绍的，窄冠黑杨11号是由山东农业大学庞金宣、李际红等通过杂交选育出的杨树优良品系，属于华北地区的主栽杨树品系类型，对其进行基因工程的抗虫改造具有重要的意义。基于此，本专利技术考虑将抗虫基因转入窄冠黑杨11号以提高其抗蛀干害虫能力。研究表明，对天牛等鞘翅目害虫具有特异杀虫活性的主要是Bt886Cry3Aa基因。但是，将Bt886Cry3Aa基因转化杨树后，由于表达量低等因素的影响，并不能有效地控制天牛。因此，选择何种抗虫基因是对窄冠黑杨11号进行抗虫改造所面临的技术难点之一。本专利技术基于Bt886Cry3Aa基因，从天牛的消化生理入手，通过采用噬菌体展示技术筛选出与天牛肠道内主要消化酶内切葡聚糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；/n(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；/n(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；/n(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；
(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；
(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；
(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗。


2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮，叶型平展的叶片。


3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA0.2mg/L-0.3mg/L和NAA0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基。


4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，暗培养的时间为24h。


5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中，农...

【专利技术属性】
技术研发人员：李际红，邢世岩，桑亚林，王锦楠，王如月，国浩平，侯丽丽，王宝锐，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37