构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法技术

本发明专利技术公开了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，涉及植物基因工程技术领域，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，利用本发明专利技术构建的载体文库混合侵染陆地棉下胚轴，通过遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对棉花抗虫性状结合抗虫鉴定结果筛选有表型的抗感虫陆地棉基因。该构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，本发明专利技术一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个基因的混合载体文库用于棉花遗传转化，本发明专利技术创建了包含五千多份愈伤两千多份再生植株的棉花基因编辑突变体文库，突变体库覆盖度高达82.07％。

【技术实现步骤摘要】
构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体为构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法。
技术介绍
基因组学主要研究基因组图谱制作、基因组测序及注释、进行基因定位与鉴定基因功能，又分结构基因组学与功能基因组学，结构基因组学以全基因组的测序及注释为主要内容，功能基因组学以基因功能的鉴定为主要内容。棉花基因组研究相对于水稻、拟南芥、烟草等植物发展落后、缓慢，随着棉花全基因测序成果的公布，相应的基因序列渐渐知晓，通过全序列分析以及基因的拼接组装，再结合转录组的数据以及生物信息学的分析，可以对基因的功能进行预测，但是预测的基因功能还必须依赖于相应突变体材料进行生物学验证，突变体是开展遗传学研究特别是功能基因组学研究中非常重要的材料，建立突变体库将加快棉花功能基因组学的研究进程。在自然条件下生物发生突变的概率只有10-5～10-8左右，想获得自然突变的材料较为困难，对自然突变的材料进行基因定位、基因功能等方面的研究相对繁琐，随着技术的不断发展人工诱导突变体的方法主要有物理、化学途径诱导，农杆菌介导的插入突变，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：/nS1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法，具体地，构建方法通过以下步骤获得：/n(1)利用CRISPR-P 2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；/n(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；/n(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分...

【技术特征摘要】
1.构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：
S1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法，具体地，构建方法通过以下步骤获得：
(1)利用CRISPR-P2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；
(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；
(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；
(4)将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库；
S2、经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料具体地构建方法通过以下步骤获得：
(1)设计4...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，孙琳，许忠平，王琼琼，李波，王福秋，王冠英，斯欢，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42