构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法技术

本发明专利技术公开了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，涉及植物基因工程技术领域，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，利用本发明专利技术构建的载体文库混合侵染陆地棉下胚轴，通过遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对棉花抗虫性状结合抗虫鉴定结果筛选有表型的抗感虫陆地棉基因。该构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，本发明专利技术一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个基因的混合载体文库用于棉花遗传转化，本发明专利技术创建了包含五千多份愈伤两千多份再生植株的棉花基因编辑突变体文库，突变体库覆盖度高达82.07％。

【技术实现步骤摘要】
构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体为构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法。
技术介绍
基因组学主要研究基因组图谱制作、基因组测序及注释、进行基因定位与鉴定基因功能，又分结构基因组学与功能基因组学，结构基因组学以全基因组的测序及注释为主要内容，功能基因组学以基因功能的鉴定为主要内容。棉花基因组研究相对于水稻、拟南芥、烟草等植物发展落后、缓慢，随着棉花全基因测序成果的公布，相应的基因序列渐渐知晓，通过全序列分析以及基因的拼接组装，再结合转录组的数据以及生物信息学的分析，可以对基因的功能进行预测，但是预测的基因功能还必须依赖于相应突变体材料进行生物学验证，突变体是开展遗传学研究特别是功能基因组学研究中非常重要的材料，建立突变体库将加快棉花功能基因组学的研究进程。在自然条件下生物发生突变的概率只有10-5～10-8左右，想获得自然突变的材料较为困难，对自然突变的材料进行基因定位、基因功能等方面的研究相对繁琐，随着技术的不断发展人工诱导突变体的方法主要有物理、化学途径诱导，农杆菌介导的插入突变，及基因敲除技术，物理、化学途径诱导的方向难以掌握，突变体难以集中多个理想性状，农杆菌介导的插入突变为水稻，玉米等提供了丰富的突变体资源，但插入位点随机获得有表型突变体效率不高，对于基因组复杂且组织培养周期长的棉花构建突变体库不适用。基因敲除的原理是利用DNA修复DSBs过程中产生的错误，诱导NHEJ途径进行修复，使基因不能正常表达，从而达到阻断或者破坏某个基因的功能的效果。基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)，类转录激活因子核酸酶(TALEN)，规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)三类，CRISPR-Cas系统工作原理简单,成为当今使用最广的基因编辑工具，CRISPR-Cas9可在多种植物中成功进行基因组定点编辑，包括小麦、番茄、大豆等，高通量基因组编辑技术最早应用在动物细胞中，且现在已成为基因筛选广泛应用的方法，高通量基因组编辑技术在植物研究相对缓慢只有水稻和玉米中突变体库，但在多倍体植物种没有相关报道。本实验室已经初步建立起适用于棉花自身特点的相对高效的低脱靶率的基因组编辑载体系统，为我们进行棉花高通量突变体库构建提供了技术支持。常规载体构建的方法只针对一个或几个编辑位点，高通量突变体库构建设计编辑位点多，常规方法需构建相同数量载体导致工作量多，因此获得快速构建载体文库的方法有重要意义，棉花(陆地棉)基因组复杂，转化周期长，转化效率低，这些因素导致建立棉花(陆地棉)全基因组基因编辑突变体库可行性不强，但是针对某一性状建立突变体库是可行的，棉花是世界上重要的经济作物之一，种植期间容易受到多种虫害的影响，近年来，刺吸式昆虫已经成为我国大部分棉花田最具破坏性的害虫，因此针对陆地棉抗虫性状建立突变体库筛选昆虫免疫相关基因具有重要意义，对基因编辑突变体材料的基因编辑情况进行检测是重要的环节之一，利用载体文库侵染棉花获得的不同突变体材料中的编辑位点及编辑水平多不相同，利用Sanger测序的方法进行检测效率低，工作量大，费用高，因此结合高通量检测技术对基因编辑突变体材料进行检测的优势突出。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，利用本专利技术构建的载体文库混合侵染陆地棉下胚轴，通过遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对棉花抗虫性状结合抗虫鉴定结果筛选有表型的抗感虫陆地棉基因。本专利技术一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个抗虫相关陆地棉内源基因的CRISPR-Cas9基因编辑混合载体文库，通过混合侵染棉花下胚轴获得陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库材料，利用高通量的检测技术对突变体材料进行检测获得基因编辑情况并后代材料进行编辑情况检测获得遗传规律，结合抗虫鉴定结果筛选得到有表型的抗感虫的陆地棉内源基因，本专利技术提供如下技术方案：通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得棉花(陆地棉)基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：S1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法(技术流程见如图1)，具体地，构建方法通过以下步骤获得：(1)利用CRISPR-P2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；(4)将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库。S2、一种能够快速检测棉花基因编辑突变体库编辑情况的高通量检测方法，及针对棉花抗虫这一性状结合抗虫鉴定结果筛选昆虫免疫相关有表型的抗感虫陆地棉内源基因(如图1所示)，经遗传转化获得棉花(陆地棉)基因编辑突变体库材料具体地构建方法通过以下步骤获得：(1)设计44条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况，其引物序列表6所示；(2)通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；(3)确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；(4)针对棉花抗虫性状通过抗虫鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系与基因编辑结果相结合筛选昆虫免疫相关有表型的抗感虫陆地棉内源基因。进一步优化本技术方案，所述的Barcode引物序列在序列表SEQIDNO:2中所示。进一步优化本技术方案，所述的抗虫相关基因编辑突变体库创建方法在陆地棉中的应用。进一步优化本技术方案，所述的检测方法在陆地棉基因组编辑材料检测中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，具备以下有益效果：1、本专利技术一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个基因的混合载体文库用于棉花遗传转化。2、本专利技术创建了包含五千多份愈伤两千多份再生植株的棉花基因编辑突变体文库，突变体库覆盖度高达82.07％。3、本专利技术利用高通量的检测方法在阳性棉花基因编辑突变体材料检测到发生基因编辑的概率高达97.29％，基因编辑类型主要为不同片段长度的缺失突变。4、本专利技术基因编辑突变体库材料中发生基因编辑情况可在后代材料中遗传，遗传率达84.55％。5、本专利技术针对棉花抗虫这一个性状建立突变体库，基因编辑突变体库材料结合抗虫鉴定可筛选到有抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：/nS1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法，具体地，构建方法通过以下步骤获得：/n(1)利用CRISPR-P 2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；/n(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；/n(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；/n(4)将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库；/nS2、经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料具体地构建方法通过以下步骤获得：/n(1)设计44条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况，其引物序列表6所示；/n(2)通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；/n(3)确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；/n(4)针对棉花抗虫性状通过抗虫鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系与基因编辑结果相结合筛选昆虫免疫相关有表型的抗感虫陆地棉内源基因。/n...

【技术特征摘要】
1.构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：
S1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法，具体地，构建方法通过以下步骤获得：
(1)利用CRISPR-P2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；
(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；
(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；
(4)将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库；
S2、经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料具体地构建方法通过以下步骤获得：
(1)设计4...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，孙琳，许忠平，王琼琼，李波，王福秋，王冠英，斯欢，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42