一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，包括如下步骤：(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体(2)整合自杀载体的筛选与转化(3)细菌的第一轮筛选(4)细菌的第二轮筛选。本发明专利技术所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法不影响细菌本身基因组的稳定性，方法在多种菌种中得到验证，且24kbp至340kbp大小的质粒都能做到质粒的高效敲除，方法简单有效，清除率高达100％。

【技术实现步骤摘要】
一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法
本专利技术属于基因编辑领域，尤其是涉及一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法。
技术介绍
质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。细菌中含有的质粒为独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。质粒对宿主生存并不是必需的，但是，质粒往往为宿主提供了环境抗性。质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属的抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。对质粒进行遗传学与功能研究时，常希望得到其消除质粒的衍生菌株，这样可以方便比较观察质粒的遗传功能，同时完全消除质粒的菌株还可以用于基因工程菌，这在分子生物学研究领域被广泛应用。质粒的消除可以减弱细菌的毒性，还可应用于细菌疫苗的研究与开发。质粒在工程菌种中有时是无用的，增加了细菌的代谢副产物，因此，质粒的消除还可在生物工程领域减少副产物的产生，降低产物纯化成本。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体：扩增拟清除质粒的特异性DNA片段，并将所述的特异性DNA片段克隆到自杀载体上，得到整合自杀载体；/n(2)整合自杀载体的筛选与转化：将所述的整合自杀载体转化到大肠杆菌感受态中，并利用抗生素筛选大肠杆菌转化子，然后将整合自杀载体从大肠杆菌转移到含有拟清除质粒的细菌中；/n(3)细菌的第一轮筛选：通过抗生素筛选出整合自杀载体与拟清除质粒发生质粒整合的细菌；/n(4)细菌的第二轮筛选：将步骤(3)中筛选出的细菌在无抗性培养基中培养，使整合后的质粒发生自然的清除，然后将细菌转移...

【技术特征摘要】
1.一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体：扩增拟清除质粒的特异性DNA片段，并将所述的特异性DNA片段克隆到自杀载体上，得到整合自杀载体；
(2)整合自杀载体的筛选与转化：将所述的整合自杀载体转化到大肠杆菌感受态中，并利用抗生素筛选大肠杆菌转化子，然后将整合自杀载体从大肠杆菌转移到含有拟清除质粒的细菌中；
(3)细菌的第一轮筛选：通过抗生素筛选出整合自杀载体与拟清除质粒发生质粒整合的细菌；
(4)细菌的第二轮筛选：将步骤(3)中筛选出的细菌在无抗性培养基中培养，使整合后的质粒发生自然的清除，然后将细菌转移到含有自杀载体所带有的自杀基因的底物的培养基中，使含有整合后的质粒的细菌生长被抑制或被杀死，不含有整合后的质粒的细菌正常生长。


2.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的转移步骤通过细菌接合或电转化的方法将整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。


3.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的转移步骤通过热激的方法将提取纯化后的整合自杀载体转化到拟清除...

【专利技术属性】
技术研发人员：季学猛，王硕，路平，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12