【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于液体的选择和细胞分离通过引用纳入PCT申请表作为本申请的一部分与本说明书同时提交。如在同时提交的PCT申请表中所确定的,本申请要求享有其权益或优先权的每个申请均通过引用方式以其全文且出于全部目的纳入本文。
本公开内容涉及微生物菌株改造的工作流(workflow)。更具体地说,它涉及减少或消除在固体培养基上铺板(plating)的基于液体的工作流。
技术介绍
微生物菌株改造包括细胞编辑过程,如转化,其产生混合的细胞群,所述细胞群包括包含一个或多个所需变化的细胞和那些没有变化的细胞。在转化或其他编辑过程之后,可以将细胞铺于含有固化剂(如琼脂)的固体生长培养基上,所述固体生长培养基含有杀死不包含所需一个或多个变化的细胞的选择或反选择添加剂。细胞生长直到出现不同的菌落,并人工挑取或使用菌落挑取机,以便对它们进行收集、基因分型和储存。在固体培养基上铺板和从固体培养基上取样是繁琐和耗时的,其中在某些情况下,铺平需要几个小时,以及菌落生长需要几天。此外,琼脂培养基易受污染,需要倒入平板,人工挑取是繁琐的,并且菌落挑取机通常是自动化菌株改造工作流中的弱点,会引入错误或故障。需要减少进行菌株改造的时间。还需要减少或消除基于琼脂的步骤和菌落挑取。
技术实现思路
本公开内容提出了用于在液体中分离遗传改变的微生物的克隆纯的样品的方法。这些方法包括在液体培养基中的选择和/或反选择。这些方法包括克隆纯的群体的基于液体的细胞选择和分离。可以进行包括选择、反选择和分离中的一个或多个的过程,而不需要在固 ...
【技术保护点】
1.一种方法,其包括:/n提供细胞的混合群,所述混合群包括第一突变细胞和非突变细胞,所述第一突变细胞具有整合到左或右同源臂上的靶DNA序列、整合到其基因组中的选择标记物和反选择标记物,所述选择标记物编码对选择剂的抗性,以及所述反选择标记物编码一种或多种在反选择条件下导致细胞死亡的蛋白质;/n在液体中,在混合群中相对于非突变细胞富集第一突变细胞,以产生均质的第一突变细胞群;和/n在液体中,从富集第一突变细胞的群的一些细胞中去除选择标记物和反选择标记物。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180703 US 62/693,7381.一种方法,其包括:
提供细胞的混合群,所述混合群包括第一突变细胞和非突变细胞,所述第一突变细胞具有整合到左或右同源臂上的靶DNA序列、整合到其基因组中的选择标记物和反选择标记物,所述选择标记物编码对选择剂的抗性,以及所述反选择标记物编码一种或多种在反选择条件下导致细胞死亡的蛋白质;
在液体中,在混合群中相对于非突变细胞富集第一突变细胞,以产生均质的第一突变细胞群;和
在液体中,从富集第一突变细胞的群的一些细胞中去除选择标记物和反选择标记物。
2.权利要求1的方法,其中所述方法的进行无需在含有固体生长培养基和选择或反选择添加剂的平板上产生克隆群。
3.权利要求1或2的方法,还包括进行转化过程以产生混合群。
4.权利要求3的方法,还包括在进行转化过程后,向混合群中添加包含选择剂的液体培养基来选择第一突变细胞。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述非突变细胞包括存留细胞,所述存留细胞是代谢不活跃的细胞。
6.权利要求5的方法,其中相对于存留细胞富集第一突变细胞包括添加冷冻保护剂,然后冷冻和解冻混合群。
7.权利要求1-6中任一项的方法,其中所述非突变细胞包括自发地对选择剂产生抗性但不具有靶DNA序列的细胞。
8.权利要求7的方法,其中相对于自发地对选择剂产生抗性但不具有靶DNA序列的细胞富集第一突体细胞包括冷冻和解冻混合群。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中所述非突变细胞包括基于质粒的存留细胞,所述基于质粒的存留细胞携带包含选择标记物的非整合质粒,并且对选择剂具有抗性,但不能增加数量。
10.权利要求9的方法,其中相对于基于质粒的存留细胞富集第一突变细胞包括稀释和过度生长混合群细胞。
11.权利要求1-4中任一项的方法,其中在混合群中相对于非突变细胞富集第一突变细胞包括冷冻和解冻混合群。
12.权利要求11的方法,其中所述冷冻和解冻是在转化后细胞恢复和向混合群中添加包含选择剂的液体培养基的操作之后进行的。
13.权利要求11的方法,其中相对于混合群中的非突变细胞富集第一突变细胞包括解冻后稀释和过度生长混合群细胞。
14.权利要求1-13中任一项的方法,其中从富集第一突变细胞的群的细胞中去除选择标记物和反选择标记物包括产生第二混合群,所述第二混合群包括第一突变细胞、第二突变细胞和基础菌株细胞,所述第二突变细胞具有靶DNA序列,但没有整合到其基因组中的选择标记物和反选择标记物。
15.权利要求14的方法,还包括分离第二混合群的细胞。
16.权利要求15的方法,其中分离第二混合群的细胞包括单个细胞的光学鉴定。
17.权利要求16的方法,其中分离细胞还包括光学鉴定的单个细胞的单细胞分配。
18.权利要求15的方法,其中分离细胞包括用活力染色剂、荧光蛋白和报告试剂中的一种或多种进行分选。
19.权利要求1-13中任一项的方法,还包括通过限制稀释过程分离富集群的细胞。
20.权利要求1-13中任一项的方法,还包括限制稀释富集群到含有反选择剂的多个孔中,使得基本上所有的孔都含有不超过一个反选择后存活的细胞。
21.权利要求1-20中任一项的方法,其中所述细胞选自:细菌细胞和真菌细胞。
22.权利要求1-20中任一项的方法,其中所述细胞为革兰氏阴性细菌细胞。
23.一种方法,其包括:
提供细胞的混合群,所述混合群包括第一突变细胞和非突变细胞,所述第一突变细胞具有整合到左或右同源臂上的靶DNA序列、整合到其基因组中的选择标记物和反选择标记物,所述选择标记物编码对选择剂的抗性;和
在液体中,在混合群中相对于非突变细胞富集第一突变细胞,以产生均质的第一突变细胞群。
24.权利要求23的方法,其中所述方法的进行无需在含有固体生长培养基和选择剂的平板上产生克隆群。
25.权利要求23或24的方法,其中所述非突变细胞包括基于质粒的存留细胞,所述基于质粒的存留细胞携带包含选择标记物的非整合质粒,并且对选择剂具有抗性,但不能增加数...
【专利技术属性】
技术研发人员:S·普斯特,V·松斯皮拉,W·赛尔贝尔,M·J·迈尔斯,S·达卢兹阿雷奥萨克莱托,P·韦曼,
申请(专利权)人:齐默尔根公司,
类型:发明
国别省市:美国;US
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