用于在重组酶介导的核酸序列向工程化的接受细胞发生盒交换整合期间追踪和操纵细胞的细胞表面标签交换(CSTE)系统技术方案

一种组合型系统，包含两个独立组件，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签‑交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签‑交换接受位点(TERS)，其编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且所述标签‑交换接受位点(TERS)还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在重组酶介导的核酸序列向工程化的接受细胞发生盒交换整合期间追踪和操纵细胞的细胞表面标签交换(CSTE)系统专利
本专利技术涉及细胞工程化和重组DNA
具体地说，本专利技术涉及在基于重组酶介导的盒交换(RMCE)的目的基因整合期间，生成、纯化、追踪和操纵工程化细胞的系统和方法。
技术介绍
在遗传操作和免疫学领域内，重组酶介导的盒交换(RMCE)已经变成定向基因修饰的有用工具，参见，例如Turan等人,Gene(2013):515:1-27。通常，确认目的基因(GOI)整合于正确位置中的RMCE后方法需要破碎细胞和处理样品。一种最近描述的方法克服了这类细胞破碎需求并且表明，可以通过追踪荧光标记蛋白表达监测和分离重组事件(Phan等人,SciRep.(2017):7(1):17771)。尽管Phan等人的方法避免了细胞破碎需求，但由于它依赖于胞内蛋白荧光，故该技术不适用于整合构建体的高内涵筛选，原因在于荧光蛋白提供的独特光谱属性集合有限；因而仅可以使用所述策略同时标记并检测有限数目的基因。另外，胞内荧光蛋白不可用于借助基材亲和法(如磁力激活细胞分选法(MACS))划分细胞的物理操作，而基材亲和法为细胞工程化作业流程期间的高通量和平行化提供可能性或为增加高内涵细胞文库工程化的效率提供可能性。目前，借助手头的RMCE技术，需要在高通量应用和高内涵应用中均进行快速和稳健细胞工程化的工具，尤其在其中已经用含有各个目的基因的汇集物的载体汇集物同时转染细胞的情况下或在其中想要通过基材亲和法选择细胞的情况下如此。因此明确需要提供有效和改进的方法。专利技术概述本专利技术涉及为在基于重组酶介导的盒交换(RMCE)的目的基因(GOI)整合期间追踪和操纵工程化细胞提供双组件细胞表面标签交换(CSTE)系统。CSTE系统的第一部分代表标签-交换供体载体(TEDV)，所述载体编码用于整合的GOI，连同旁侧有包含剪接受体位点的内含子序列3’片段的第一细胞表面标签(CST)。TEDV构建体旁侧有RMCE元件。CSTE的第二部分代表了包含于工程化靶细胞的基因组内部的标签-交换接受位点(TERS)，所述标签-交换接受位点编码由完整内含子序列毗连的选定基因和具有符合可读框跨膜结构域的第二CST，所述的完整内含子序列编码RMCE元件和侧置于GOI编码序列的第二RMCE元件。TERS编码的CST实质上编码为单个内含子毗连的两个外显子。如此设计纳入TEDV和TERS的配对RMCE元件，从而RMCE在两个构建体之间的执行导致将CST和GOI从TEDV交换入TERS，相应失去TERS编码的TERSCST和选择基因。TEDV递送的CST利用TERS编码的跨膜结构域，其中RMCE的执行导致交换独特的CST外显子序列。从TERS驱动CST和选择基因/GOI表达的启动子元件相对于交换过RMCE的构建体是外来的，因此TEDV递送的序列通常将仅在可靠地执行RMCE时才表达。这种CSTE系统使得通过检测CST在细胞表面呈递的亲和力表位有条件报告的快速和稳健的RMCE成为可能，并且还使得借助基材固定的亲和力方法物理划分细胞成为可能。通过使用多价亲和力表位作为CST元件，这种CSTE系统还使得GOI整合过程的多路复合和谱系追踪成为可能。CSTE系统代表一种在高通量应用和高内涵应用中进行快速和稳健细胞工程化的强有力工具。在第一方面，本专利技术提供一种包含两个独立组件的组合型系统，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签-交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，其编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且其还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。在一个实施方案中，第一组件是一种TEDV，其包含a.在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的第一RMCE元件–5’RMCE元件b.3’内含子片段，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点c.外显子，其包含处于5’至3’方向的TEDV所编码的CSTd.按5’至3’方向的，编码的CST的第一转录终止子序列e.3’至5’编码的GOI的第二转录终止子f.按3’至5’方向的，编码GOI的序列g.Kozak序列h.5’RMCE元件其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。在另一个实施方案中，第二组件是一种TERS，其包含a.转录启动子元件b.Kozak序列c.2型膜蛋白跨膜结构域外显子d.5’内含子剪接供体位点e.在非编码和‘无功能’3’内含子片段中编码的5’RMCE元件，且其与TEDV的5’RMCE元件作为等同物并配对f.3’内含子片段的有功能序列，其含有分支点序列、多聚嘧啶串和3’接纳体剪接位点g.包含处于5’至3’方向TERS所编码的CST(其异于TEDV所编码CST)的外显子h.按5’至3’方向的，编码的CST的转录终止子序列i.用于3’至5’方向的转录终止子序列j.按3’至5’方向的，编码选择基因的序列k.用于选择基因转录物高效翻译起始的Kozak序列l.3’RMCE元件m.负责调节CST转录物表达及其追踪的3’基因组元件，其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。在第二方面，本专利技术提供一种从TERS基因座生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，a.生成编码GOI的TEDVb.向含有配对TERS的工程化细胞系递送所述TEDV，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶c.使细胞与两种或更多种对TEDV所编码CST和TERS所编码CST均特异的亲和试剂接触d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和TEDV所编码CST的表达增加，选择衍生性工程化细胞，作为选择GOI已整合的细胞的代理(proxy)。在第三方面，本专利技术提供一种标签-交换供体载体(TEDV)，其编码旁侧有3’内含子片段的细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)。在第四方面，本专利技术提供一种在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)的工程化细胞，所述标签-交换接受位点编码由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的细胞表面标签(CST)外显子，并且还编码处于反义方向的报告基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合型系统，包含两个独立组件，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签-交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，其编码与第一CST不同的、由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180709 EP 18182353.51.一种组合型系统，包含两个独立组件，其中第一组件是编码旁侧有3’内含子片段的第一细胞表面标签(CST)外显子和处于反义方向的目的基因(GOI)的标签-交换供体载体(TEDV)，并且第二组件是工程化细胞，所述的工程化细胞在其基因组内部含有标签-交换接受位点(TERS)，其编码与第一CST不同的、由完整内含子序列毗连至编码跨膜结构域的外显子的第二CST外显子，并且还编码处于反义方向的报告基因，其中配对的重组酶介导盒交换(RMCE)元件如此纳入TEDV和TERS中，从而RMCE在TEDV和TERS之间的执行导致报告元件交换成TEDV编码的GOI，以及第一CST外显子交换成第二CST外显子，从而衍生性工程化细胞现在表达第一CST和GOI，替代第二CST和报告基因。


2.根据根据权利要求1所述的组合型系统，其中第一组件是TEDV，其包含
a.第一RMCE元件
b.3’内含子片段
c.CST外显子
d.第一转录终止子
e.第二转录终止子
f.GOI
g.Kozak序列
h.第二RMCE元件
其中CST外显子和第一转录终止子以从GOI和相关的转录终止子和Kozak序列的反义方向编码。


3.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中第二组件是TERS，其包含
a.转录启动子元件
b.Kozak序列
c.跨膜结构域外显子
d.内含子
e.内含子序列内部编码的第一RMCE元件
f.CST外显子
g.第一转录终止子
h.第二转录终止子
i.报告基因
j.Kozak序列
k.第二RMCE元件
l.第二转录启动子元件
其中跨膜结构域外显子和CST外显子以从报告基因的反义方向如此编码，从而第一转录启动子元件驱动合并的跨膜结构域和CST转录，并且第二转录启动子元件驱动报告基因转录。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合型系统，其中TEDV的第一RMCE元件与TERS的第一RMCE元件配对，并且TEDV的第二RMCE元件与TERS的第二RMCE元件配对。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合型系统，其中每个CST外显子包含了编码一个或多个分子亲和标签的序列并且由TEDV和TERS编码的CST是不同的。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合型系统，其中工程化细胞在其基因组中含有单个TERS。


7.从TERS基因座生成表达TEDV所编码GOI的衍生性工程化细胞的方法，所述方法包括，
a.生成编码GOI的TEDV
b.向含有配对TERS的工程化细胞系递送所述TEDV，连同匹配其中所编码RMCE元件的重组酶
c.使细胞与对TEDV编码的CST和TERS编码的CST都特异的两种或更多种亲和试剂接触
d.基于报告基因和TERS所编码CST的表达削弱和TEDV编码的CST表达增加，选择衍生性工程化细胞，作为选择整合有GOI的细胞的代理。


8.根据权利要求7所述的方法，其中用于步骤c.的亲和试剂是荧光标记的，从而检测削弱的TERS编码的CST表达和增加的TEDV编码的CST表达，从而使得基...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·M·贾维斯，L·B·帕塞，R·E·希尔，
申请(专利权)人：杰诺维有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE