用于全长T细胞受体可读框的快速装配和多样化的两组分载体文库系统技术方案

包含两个独立组分的组合型系统，其中第一组分是携带可变和恒定(V‑C)T细胞受体(TCR)基因区段的载体，并且第二组分是携带TCR连接(J)基因区段的载体。可以如此修饰该合并型系统，从而所述第一组分是编码第一TCR链的修饰的V‑C入门载体，所述系统还包含第四和第五组分，其中第四组分包含双向终止子(BiT)供体载体，并且第五组分包含编码与所述第一TCR链互补的第二TCR链的修饰的V‑C入门载体。

A two-component vector library system for rapid assembly and diversification of full-length T cell receptor readable frames

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于全长T细胞受体可读框的快速装配和多样化的两组分载体文库系统
异二聚T细胞受体(TCR)是适应性免疫的核心。在T细胞生成期间独特TCR持续产生，因而一系列基因区段重组成单个连续TCR可读框(ORF)。归因于这个重组过程中产生的庞大程度的多样性，难以从单个细胞中表达的TCR对中采集序列数据。另外，这种多样性还造成难以在遗传构建体内基于高通量提供这些TCR可读框(ORF)以检验和操作TCR功能。在第一方面，本专利技术提供预装配的两组分载体文库系统，其由可变-恒定入门载体(V-C入门)和连接供体(J供体)载体组成，包含TCR基因区段的一些部分。该双组分系统以如此方式设计，从而当选自V-C入门载体文库的V-C入门载体与选自J供体载体文库的J供体载体，连同编码TCR互补决定区3的合成DNA寡核苷酸双链体(odeCDR3)，在限制性酶消化/连接酶循环反应中组合时，可以产生单一载体，重构全长TCRORF。这种载体文库系统使得PCR非依赖性方法可以用于在选定载体背景下快速和成本有效地产生TCRORF。此外，这种系统允许以新颖过程产生合成的TCR序列用于亲和力和/或功能成熟过程。这种TCRORF重构和工程化系统(TORES)因此是用于TCR功能性分析和工程化的强大工具。在第二方面，提供具有修饰的V-C入门载体的TORES，连同第三组分双向终止子供体载体(BiT供体)，从而能够实现将两个TCRORF链对以反平行编码含义连接成单一产物载体的第二步骤。这种双向TORES2系统能够实现备选作业流程以递送配对的TCRORF构建体用于TCR操作和表征。r>专利技术背景T淋巴细胞(T细胞)的免疫监视是全部有颌类脊椎动物的适应性免疫中的核心功能。T细胞免疫监视通过T细胞亚型的丰富功能多样性来实现，这些T细胞亚型的作用包括，消除病原体感染细胞和肿瘤细胞、以及协调适应性免疫应答以对抗正在入侵的病原体、共生性微生物、共生非自我因素(如食品原料的分子组分)、和甚至维持自我免疫耐受性。为了响应于各种外来因素和自我因素，T细胞必须能够特异性检测这些外来因素和自我因素的分子组分。因此T细胞必须能够以足够的特异性来检测个体遭遇到的庞大自我分子和非自我分子，从而针对致病生物和患病自我发动有效应答，同时避免对健康自我发动这类应答。考虑到外来分子和自我分子的多样性实际上不受限制且致病生物处于逃避T细胞检测的进化压力下，这项任务的高度复杂性质是明显的。T细胞受体(TCR)T细胞主要依据表达的T细胞受体(TCR)界定。TCR是T细胞的组分，其负责与T细胞适应性免疫的靶标相互作用并感知该靶标。概括而言，TCR由呈递在细胞表面上的异二聚体蛋白质复合体组成。两条TCR链各自由两个胞外结构域组成，即可变(V)区和恒定(C)区，两者均为免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，形成反平行β-片层。这些结构域由连接短胞质尾的I型跨膜结构域锚定在细胞膜中。T细胞能够适应并且检测分子组分多样性的性质，源自TCR链在T细胞发生期间产生的变异。这种变异与类似于B细胞中抗体生成的方式通过体细胞重组而产生。TCR链多样性T细胞集合由几个功能上和表型上异质的亚群组成。但是，T细胞可以根据它们在表面表达的经体细胞重排的TCR形式，广义地划分为αβ或γδ。存在两种TCR链对形式；TCRα(TRA)和TCRβ(TRB)对；和TCRγ(TRG)和TCRδ(TRD)对。表达TRA:TRB对的T细胞称作αβT细胞，而表达TRG:TRD对的T细胞经常称作γδT细胞。αβ形式和γδ形式的TCR负责识别多样的配体或‘抗原’，并且每个T细胞在T细胞成熟期间从头生成αβ或受体链。这些新生TCR链对通过在称作体细胞V(D)J重组的过程中产生受体序列多样性，实现多样性识别，此后，每个T细胞表达单一一种独特重排的TCR的拷贝。在TRA基因座和TRG基因座，多个离散的可变(V)和功能(J)基因区段可用于重组并与恒定(C)基因区段并置，因此称作VJ重组。在TRB基因座和TRD基因座处的重组额外地包括多样性(D)基因区段，并且称作VDJ重组。每个重组的TCR具有用于独特配体特异性的潜力，这由α链和β链(在αβT细胞情况下)或γ链和δ链(在T细胞情况下)形成的配体结合位点的结构决定。TCR的结构多样性主要限于每条链上的三个短发夹环，称作互补决定区(CDR)。受体链对的每条链各贡献三个CDR，合在一起这六个CDR环位于TCR胞外结构域的远膜端，形成抗原结合位点。每条TCR链中的序列多样性以两种方式实现。首先，通过随机选择基因区段以重组，提供了基本的序列多样性。例如，TRB重组在47个独特V、2个独特D和13个独特J种系基因区段之间发生。通常而言，V基因区段贡献CDR1环和CDR2环，并且因此是种系编码的。产生序列多样性的第二方式出现在高变性CDR3环内部，其中通过在正在重组的V、(D)和J基因区段之间的交界处随机缺失模板核苷酸和加入非模板核苷酸，产生所述CDR3环。TCR:CD3复合体成熟的αβ和γδTCR链对在细胞表面呈递，与多种称作ε、γ、δ和ζ的辅助CD3亚基形成复合体。这些亚基以三种二聚体(εγ、εδ、ζζ)形式与αβ或γδTCR缔合。这种TCR:CD3复合体形成当αβ或γδTCR与同族抗原(cognateantigen)接合时启动细胞信号传导响应的单位。缔合在TCR:CD3复合体中的CD3辅助亚基贡献了信号传导基序，其称作免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ε，CD3γ和CD3δ各自贡献单一ITAM，而CD3ζ同型二聚体含有3个ITAM。与TCR装配的三种CD3二聚体(εγ、εδ、ζζ)因此贡献10个ITAM。一旦TCR与同族抗原连接，则串联酪氨酸残基的磷酸化可以为含有Src同源性2(SH2)结构域的蛋白质(如关键的70kDaζ链缔合蛋白(ZAP-70))提供配对的对接位点。招募这类蛋白质将启动最终负责T细胞活化和分化的TCR:CD3信号传导复合体的形成。αβT细胞人类中αβT细胞通常比其γδT细胞对应物更丰富。大部分的αβT细胞与细胞表面上由HLA复合体呈递的肽抗原相互作用。首先描述了这些识别肽-HLA(pHLA)的T细胞并且迄今最充分表征了这些细胞。也已经描述了比较少见形式的αβT细胞。粘膜相关的不变T(MAIT)细胞看起来具有相对有限的α链和β链多样性，并且识别细菌代谢物而非蛋白质片段。不变天然杀伤T细胞(iNKT细胞)和种系编码的分枝酰(mycolyl)反应性T细胞(GEMT细胞)限于识别由非HLA分子交叉呈递的糖脂。大部分认为iNKT细胞与CD1d呈递的糖脂相互作用，而GEMT细胞与CD1b呈递的糖脂相互作用。其他形式的T细胞据认为与CD1a和CD1c背景中的糖脂相互作用，然而，这些细胞仍待详细表征。常规αβT细胞大部分αβT细胞的关键特征是识别HLA分子背景下的肽抗原。这些细胞经常称作‘常规’αβT细胞。在个体内部，自我-HLA分子向T细胞呈递源于自我和外来蛋白的肽，从而为针对恶性肿瘤和外来病原体的适应性免疫、针对共生生物、食品原料和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含两个独立组分的组合型系统，其中第一组分是携带可变和恒定(V-C)T细胞受体(TCR)基因区段的载体，并且第二组分是携带TCR连接(J)基因区段的载体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170718 EP 17181798.41.包含两个独立组分的组合型系统，其中第一组分是携带可变和恒定(V-C)T细胞受体(TCR)基因区段的载体，并且第二组分是携带TCR连接(J)基因区段的载体。


2.根据权1利要求所述的组合型系统，其中第一组分是V-C入门载体，其含有
a.复制起点
b.第一正向选择标记
c.一个5'遗传元件或多个5'遗传元件，
d.Kozak序列
e.TCR可变基因区段，
f.第一IIS型序列，用于被第一IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'并在TCR可变基因区段的3'末端切割，
g.负向选择标记，
h.第二IIS型序列，用于被第二IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割到所述识别序列的3'直接切割和在TCR基因恒定区段的5'末端切割，
i.TCR恒定基因区段，和
j.一个3'遗传元件或多个3'遗传元件。


3.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中第二组分是J供体载体，其含有
a.复制起点
b.第二正向选择标记，
c.第三IIS型序列，用于被第三IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的3'和在TCR连接基因区段的5'末端切割，
d.TCR连接基因区段，
e.C部分，对应于恒定基因区段的5'小部分，和
f.第四IIS型序列，用于第四IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'和在构建体的TCRC-部分区的3'末端切割，从而生成的单链突出端序列与权利要求2h中限定的第二IIS型序列产生的那个单链突出端序列互补。


4.根据权利要求2-3中任一项所述的组合型系统，其中5'遗传元件包含一个或多个选自以下的元件
a.基因顺式/作用元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的5'同源重组臂，
d.mRNA剪接受体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。


5.根据权利要求2-4中任一项所述的组合型系统，其中负向选择标记选自
a.不含于第一组分中或TCR连接基因区段内部其他地方的限制性酶识别位点，
b.细菌自杀基因，和
c.报道元件。


6.根据权利要求2-5中任一项所述的组合型系统，其中3'遗传元件包含一个或多个选自以下的元件
a.终止子元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的3'同源重组臂
d.mRNA剪接供体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。


7.根据权利要求2-6中任一项所述的组合型系统，其中组分不含有如上文限定的那些以外的任何IIS型序列，并且仅含有如权利要求5中限定的负向选择标记。


8.根据前述权利要求中任一项所述的组合型系统，还包含第三组分，其包含编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)，其中odeCDR3具有
a.第一单链突出端序列，其与通过在TCR可变基因区段的3'末端切割第一IIS型限制性位点产生的单链突出端序列互补，
b.双链区段，其编码TCRCDR3区并缺少负向选择标记，所述负向选择标记如权利要求5中限定，并且所述双链元件还缺少第一或第二组分的任何IIS型限制性序列，和
c.第二单链突出端序列，其与通过在TCR连接基因区段的5'末端切割第三IIS型限制性酶位点产生的单链突出端序列互补。


9.根据权利要求1-7中任一项所述的组合型系统，还包含第三组分，所述第三组分包含编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)，其中odeCDR3是编码旁侧分布有两个IIS型识别和切割位点的CDR3的dsDNA分子或质粒DNA，从而被所述酶切割产生单链突出端，所述单链突出端与用第一IIS型切割在V-C入门载体中5'末端处和用第三IIS型切割J供体载体在3'末端所产生的那些单链突出端互补，以获得所述odeCDR3的消化产物，所述消化产物包含如权利要求8中所述的a、b和c。


10.根据权利要求2-9中任一项所述的组合型系统，其中第一至第四IIS型序列相同或不同。


11.根据权利要求1-10中任一项所限定的V-C入门载体文库和J载体供体文库的两部分载体文库，其中V-C入门载体文库是
代表具有这类TCR的生物的全部种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，或
代表具有这类TCR的生物的一组变体种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列未修饰，或
代表具有这类TCR的生物的一组变体种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列修饰，并且其中
J供体载体文库是代表具有这类TCR的生物的种系TCR连接基因区段的一个或多个载体的集合，或
代表具有这类TCR的生物的变体种系TCR连接基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列未修饰，或
代表具有这类TCR的生物的变体种系TCR连接基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列经修饰。


12.一种用于体外重构全长TCR可读框(ORF)的方法，所述方法包括
a.选择V-C入门载体，
b.选择J供体载体，
c.选择odeCDR3，
d.将a、b和c组合，以i)与(一种或多种)IIS型限制性酶反应，从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应并且使合并的混合物经历热循环反应，
e.将获得自步骤d.的反应产物转化入有能力进行DNA载体增殖的宿主生物，以及
f.增殖所述宿主生物以获得在所得的V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。


13.V-C入门载体，与J供体载体和odeCDR3组合用于重构全长TCRORF，其中V-C载体选自
序列SEQ0692，适用于哺乳动物宿主细胞中瞬时表达或重构的全长TCR可读框；
序列SEQ0693，适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换；和
序列SEQ0694，适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换。


14.J供体载体，由序列SEQ0700代表。


15.如权利要求1-10中任一项所述的V-C入门载体文库，与J供体载体和...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·M·贾维斯，R·E·希尔，L·B·帕塞，
申请(专利权)人：杰诺维有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE