一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型和方法技术

本发明专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型和方法，所述模型为通过将所述原代肝癌组织移植到模型生物体内，再将嵌合抗原受体T细胞移植到模型生物体内而获得。本发明专利技术的模型可有效模拟病人的肿瘤恶性程度，评估CAR T细胞对不同恶性程度的肝癌的抑制作用；本发明专利技术模型可有效评估原代肝癌细胞中的免疫抑制检查点分子的表达对CAR T细胞的抑制作用。

A model and method for detecting inhibitory effects of chimeric antigen receptor T cells on liver cancer cells

The invention relates to the field of immunotherapy of tumors, especially relates to the inhibition of the model and method of detection of a chimeric antigen receptor of T cells on liver cancer cells, the model for the primary liver cancer tissue transplantation to the model organism, the chimeric antigen receptor T cells transplanted into model organisms obtained. The model can effectively simulate the malignant degree of tumor patients, evaluation of CAR inhibitory effect of T cells on different malignant degree of liver cancer; the invention can inhibit the expression of effective evaluation model of immune suppression in primary hepatocellular carcinoma cell checkpoint molecule of CAR T cells.

【技术实现步骤摘要】
一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型和方法
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型和方法。
技术介绍
肝癌是亚洲死亡率最高的癌症之一。目前，肝癌有效的治疗方法是部分肝脏切除、肝脏移植、化疗、动脉化疗栓塞。尽管在肝癌诊断和治疗上都有许多的新发现，然而，肝癌的五年生存率仍然只有10％。目前，许多新的潜在免疫治疗手段都开展了临床试验，如CART细胞免疫治疗、免疫抑制检查点抗体。鉴于低生存率，严谨而有效模拟人体的临床前评估模型是目前肝癌治疗研发平台的紧急需求。然而对于实体瘤而言，嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)T细胞的临床前试验结果与临床试验结果存在着巨大的差异，导致目前通过临床审批、成为上市药物的实体瘤CART细胞治疗寥寥可数。而CART细胞的临床前和临床治疗结果差异巨大的原因还未知，但可能是多因素影响的。通过对比血液肿瘤和实体瘤之间的差异，推测实体瘤体内微环境中可能存在的CART细胞阻碍：1)突破实体瘤组织物理屏障，肿瘤组织存在妨碍CART细胞浸润至肿瘤部位的物理屏障；2)肿瘤代谢微环境中相对酸性、缺乏氧和营养物质，阻碍CART细胞生存、增殖和杀伤作用；3)肿瘤抑制性分泌因子和细胞因子的免疫抑制作用；4)免疫抑制细胞，如调节性T细胞(RegulatoryTcells，Tregs)、髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcells，MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)和嗜中性粒细胞(Neutrophils，TANs)。而以上列举的条件是常规实体瘤细胞系构建的异种移植小鼠模型无法重现的，导致实体瘤CART细胞疗效的临床前评估不准确，临床前和临床治疗结果差异悬殊。现有技术中存在的都是将肝癌细胞系体外识别杀伤评估和肝癌细胞系体内识别杀伤评估，而肝癌细胞系的体内识别杀伤评估是现有的CART细胞临床前疗效评估方法。然而该方法无法有效模拟CART细胞对肝癌异质性、肿瘤组织物理屏障和代谢屏障、免疫抑制微环境等效应的疗效。对于CART细胞，原代肿瘤细胞异质性将可能是CART细胞治疗耐药的重要原因之一，而肿瘤细胞系构建的疗效评估模型却无法重现的肿瘤异质性对CART细胞的耐药作用。由此可见，实体瘤CART细胞的临床前评估方法并未成熟，亟需发现新的方法。此外，肝癌又是实体瘤中的一个特殊例子。因为而肝脏组织是一个特殊的器官，参与人体造血过程。肝脏亦被称为免疫幸免器官，即肝脏移植发生移植物排斥宿主疾病的概率远远低于其它器官移植，但具体的作用机制并未见报道。但由此可推知，肝脏组织存在某种缓解免疫效应的作用机制。CN102178568A公开了一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。但其无法用来评估CART细胞在体内的疗效。CART细胞对人体肝癌的临床治疗则可能受到更强烈的免疫抑制作用，靶向肝癌的CART细胞对肝癌临床前评估模型的要求更高。
技术实现思路
针对目前靶向肝癌CART细胞临床前评估手段无法有效模拟和评估肝癌CART细胞的体内疗效，本专利技术提供一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型和方法，通过在高度免疫缺陷小鼠体内移植肝癌病人来源的肿瘤组织块，并将肝癌CART细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代肝癌异种移植模型，并利用该模型评估靶向肝癌CART细胞的临床前疗效。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型，所述模型为通过将所述原代肝癌组织移植到模型生物体内，再将嵌合抗原受体T细胞移植到模型生物体内而获得。优选地，所述原代肝癌组织移植的体积为1-5mm3，例如可以是1mm3、2mm3、3mm3、4mm3、5mm3，优选为2-3mm3。优选地，所述原代肝癌组织移植的数量为1-5块，例如可以是1块、2块、3块、4块、5块，优选为2-3块。优选地，所述嵌合抗原受体T细胞移植的数量为(1-4)×10-6，例如可以是1×10-6、2×10-6、3×10-6、4×10-6，优选为2×10-6。本专利技术中，所述模型用于非治疗目的的检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用，通过将肝癌病人来源的肿瘤组织移植入免疫缺陷小鼠体内，并将肝癌CART细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，构建可有效模拟肝癌病人体内病理微环境的人源化小鼠模型，并在该模型中模拟临床治疗模型多次移植CART细胞，确保CART细胞的稳定供给，CART细胞激活将高表达PD-1、CTLA-4、TIM3等免疫抑制检查点受体，拟靶向杀伤的肝癌细胞的免疫抑制检查点配体的表达与否，及其辅助免疫抑制微环境形成的因素，将极大程度决定CART细胞的体内肿瘤杀伤能力，并通过肿瘤监控评估CART细胞对肝癌的治疗作用。根据本专利技术，所述原代肝癌组织为边缘淡黄色组织和/或中间白色组织，优选为边缘淡黄色组织，所述边缘淡黄色组织能够更好的与模型生物相容。根据本专利技术，所述将所述原代肝癌组织移植到模型生物体内的移植方式为皮下移植、肾囊膜下移植或肝脏原位移植中的一种或至少两种的组合，优选为肝脏原位移植，所述肝脏原位移植通过肝脏微环境可有效促进肝癌细胞及肝癌相关细胞如MDSC、Treg、TAM、TAN等的生存，则可有效模拟肝癌相关细胞对肝癌肿瘤起始、扩增、迁移、耐药等的作用，更真实地模拟嵌合抗原受体T细胞在人体肝癌微环境中的细胞效应和抑制作用。所述的皮下移植具体步骤如下：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，每只受体小鼠移植2-3小块，将肝癌肿瘤组织小块用基质凝胶(MatrixGel)包裹备用，用剪刀在小鼠下腹部一侧剪开小口，用镊子将MatrixGel包裹的肿瘤组织块夹入小口中，用伤口夹将小口缝合；肿瘤监控：通过游标卡尺定时量取肿瘤体积监控肿瘤生长和对药物的反应；或通过荧光素酶-活体成像技术检测；或通过流式细胞技术和免疫组化技检测。所述的肾囊膜下移植具体步骤如下：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成体积为2mm3的肿瘤组织小块备用，每只受体小鼠移植2-3小块；将小鼠麻醉，选取小鼠一侧肾脏，在肾包囊上开小口(开口大小与移植管口相当)，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，以移植管吸取带一只的聚合卵巢并移植茹受体小鼠肾囊膜下(远离手术开口)，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒；肿瘤监控：通过荧光素酶-活体成像技术检测，或通过流式细胞技术和免疫组化技术检测。所述的肝脏原位移植具体步骤如下：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成体积为2mm3的肿瘤组织小块备用，每只受体小鼠移植2-3小块；麻醉小鼠，沿腹中线剪开小鼠皮肤和腹膜，暴露肝叶，挤出肝脏左外叶，用眼科沙眼铲在肝左外叶中部戳一个3-5mm长孔，棉签局部止血后，用镊子将肿瘤组织块夹入小孔内，用激光笔闭合伤口并止血，用青霉素-生理盐水涂抹伤口，缝合腹膜和皮肤，用碘酒消毒伤口；肿瘤监控：通过荧光素酶-活体成像技术检测，或通过流式细胞技术和免疫组化技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型，其特征在于，所述模型为通过将所述原代肝癌组织移植到模型生物体内，再将嵌合抗原受体T细胞移植到模型生物体内而获得。

【技术特征摘要】
1.一种检测嵌合抗原受体T细胞对肝癌细胞抑制作用的模型，其特征在于，所述模型为通过将所述原代肝癌组织移植到模型生物体内，再将嵌合抗原受体T细胞移植到模型生物体内而获得。2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于，所述原代肝癌组织移植的体积为1-5mm3，优选为2-3mm3；优选地，所述原代肝癌组织移植的数量为1-5块，优选为2-3块；优选地，所述嵌合抗原受体T细胞移植的数量为(1-4)×10-6，优选为2×10-6；优选地，所述原代肝癌组织为边缘淡黄色组织和/或中间白色组织，优选为边缘淡黄色组织；优选地，所述将所述原代肝癌组织移植到模型生物体内的移植方式为皮下移植、肾囊膜下移植或肝脏原位移植中的一种或至少两种的组合，优选为肝脏原位移植。3.根据权利要求1或2所述的模型，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞在所述原代肝癌组织移植到模型生物体内的5-10天后进行移植，优选为6-8天进行移植，进一步优选为7天；优选地，所述嵌合抗原受体T细胞进行多次移植，优选为进行2-4次移植，进一步优选为进行2次移植；优选地，所述嵌合抗原受体T细胞进行多次移植，其中相邻两次移植的间隔时间为5-10天，优选为6-8天，进一步优选为7天。4.根据权利要求1-3中任一项所述的模型，其特征在于，所述模型生物体为兔、鼠、猫、狗或猴中的任意一种或至少两种组合的模型，优选为免疫缺陷型小鼠模型，进一步优选为NOD/SCID、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1/-IL2rg-/-、NOD/SCIDIL2rg-/-小鼠模型，最优选为NOD/SCIDIL2rg-/-小鼠模型。5.根据权利要求1-4中任一项所述的模型，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞为特异性识别肝癌细胞的嵌合抗原受体T细胞；优选地，所述嵌合抗原受体T细胞中的嵌合抗原受体主要包括信号肽、抗原识别区...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，蒋治武，吴迪，林思妙，李柏衡，王素娜，吴绮婷，陈冬梅，姚瑶，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44