本发明专利技术公开了包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用，包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子；通过将CD27分子胞内信号域与T细胞活化相关的刺激信号连接，可显著增加T细胞体外增殖和凋亡作用，提升CAR‑T细胞中起体内治疗作用的幼稚样Tscm细胞(CD45RA+CD62L+)和中心记忆细胞(CD45RO+CD62L+)细胞的比例；降低抑制免疫作用的IL‑10因子的表达，对CAR‑T(T细胞嵌合抗原受体)细胞治疗效果的具有显著提升作用，为CAR‑T细胞治疗领域提供一种新的思路和选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，还涉及包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体和应用。
技术介绍
过继细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)是生物治疗技术的一种，对自体免疫细胞(主要是T细胞)进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患者以达到治疗目的的方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种治疗方式，在临床治疗中受到广泛应用。过继细胞治疗广泛应用的主要是：淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，LAK)与IL-2联合治疗晚期恶性肿瘤取得了一定疗效；肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)临床试验中治疗转移性黑色素瘤取得了较好的效果；细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，CIK)，目前国内开展较多的临床试验，对肝癌、肺癌等肿瘤取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化T细胞，T细胞活化需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-Ⅰ分子结合为活化的第一信号，决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号，决定T细胞增殖。但肿瘤细胞、肿瘤微环境可下调MHC、配体分子，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。因此需要可进行基因改造，主要有两种方式：基因转导TCR(T cell receptor，TCR)和嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。CAR是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB(CD137)，CD28，ICOS(CD278)。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体较TCR改造更具优势：(1)特异性：抗体(配体)特异性识别抗原(受体)；(2)效率高：不会出现转基因TCR与患者内源性TCR发生错配；(3)非MHC-Ⅰ限制性：不需要与MHC-Ⅰ分子结合，可克服肿瘤细胞、肿瘤微环境下调MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸；(4)抗原选择范围广：抗原可以是糖类、脂类、蛋白质。目前CAR修饰的免疫细胞治疗的临床试验大量开展，其中，抗CD19、CD20 CAR修饰的T细胞治疗B系肿瘤效果显著。实体肿瘤临床试验则有抗叶酸
嵌合抗原受体治疗卵巢癌，抗碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ)嵌合抗原受体治疗肾癌，抗二唾液酸神经节苷脂(GD2)嵌合抗原受体治疗经母细胞瘤等。人记忆性干细胞样T细胞(Tscm)是新发现的一个T细胞亚群。这一类群的细胞具有干细胞的特征，具有较强的多向分化潜能，Tscm细胞能够分化为中枢性记忆性T细胞(Tcm)，效应性记忆性T细胞(Tem)和效应性T细胞(Tef)，在分化的同时又能够维持自我更新。研究显示这群细胞是T细胞发挥体内抗肿瘤活性的重群体，因此如何在获得高比例的Tscm群体的CAR-T细胞是目前学界追逐的热点与难点。人CD27基因定位于12号染色体短臂1区1带(12pl1)，是由二硫键连接的相对分子量为55000的单体组成的二聚体跨膜糖蛋白，相对分子量为12000，是一类I型跨膜，CD27及其配体CD70是TNF.TNFR超家族的两个重要成员，两者之间的相互作用可以调节T、B及NK细胞的增殖和分化。糖蛋白CD27所用的信号机制将不同于免疫球蛋白家族所用到的CD28和TCR。它们通过链接TRAF家族成员。TRAF2和TRAF5，诱导NF-κB和c-Jun-N末端激酶信号通路，从而促进T细胞的增殖及相应细胞因子的分泌。研究显示CD27-CD70信号对T细胞在体内长期存活具有重要作用，因此联想到CD27-CD70信号通路是否对T细胞形成或维持Tscm具有重要作用。目前还没有使用CD27分子与其他共刺激分子共同组合用于嵌合抗原受体的构建，也没有报道显示CD27分子对Tscm的形成具有促进作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体；本专利技术的目的之二在于提供表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体；本专利技术的目的之三在于提供所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；本专利技术的目的之四在于提供利用所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体制备的表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的免疫细胞；本专利技术的目的之五在于提供所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体靶向肿瘤细胞的药物中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子，所述CD27分子胞内信号域的氨
基序列如SEQ ID NO.20所示，所述T细胞共刺激信号分子为CD137、CD28和CD278中的一种或多种组合。本专利技术中，所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD28与CD27，CD137与CD27，CD134与CD27，CD278与CD27和CD28、CD137与CD27的组合。本专利技术中，所述免疫受体酪氨酸活化基序还包括信号传导结构域，所述信号传导结构域可以为CD3ζ或FcεRIγ信号链，优选为CD3ζ信号链。本专利技术中，所述嵌合抗原受体依次由前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。本专利技术中单链抗体ScFv可以是靶向任意抗原的单链抗体ScFv，如靶向CEA抗原CEA基因家族成员5，CEACAM5(CD66e)，靶向CD19分子、靶向CD20分子、靶向EGFR分子等任意单链抗体，实施列中为靶向CEA抗原CEA基因家族成员5来源的单链抗体；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示本专利技术中，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.10所示。2、表达包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体的慢病毒载体，所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和含有CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述前导肽位于所述启动子下游，所述含有CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。优选的，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体ScFv为抗人CEA抗原的单链抗体ScFv，所述抗人CEA抗原的单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述C本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子，所述CD27分子胞内信号域的氨基序列如SEQ ID NO.20所示，所述T细胞共刺激信号分子为CD137、CD28和CD278中的一种或多种组合。
【技术特征摘要】
1.包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的免疫受体酪氨酸活化基序含有CD27分子胞内信号域和与T细胞共刺激信号分子，所述CD27分子胞内信号域的氨基序列如SEQ ID NO.20所示，所述T细胞共刺激信号分子为CD137、CD28和CD278中的一种或多种组合。2.根据权利要求1所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD28与CD27，CD137与CD27，CD134与CD27，CD278与CD27或CD28、CD137与CD27的组合。3.根据权利要求1所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述免疫受体酪氨酸活化基序还包括信号传导结构域，所述信号传导结构域为CD3δ或FcεRIγ信号链。4.根据权利要求1～3任一项所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次由前导肽、单链抗体ScFv、CD8a铰链区、跨膜区和包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序，所述包含CD27胞内结构域的免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。5.根据权利要求4所述包含CD27胞内结构域的嵌合抗原受体，其特征在于：所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体ScFv为抗人CEA抗原的单链抗体ScFv，所述抗人CEA抗原的单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID N...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱程，杨智，沈俊杰，单娟娟，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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