本发明专利技术公开了一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，所述表达载体克隆区上游包含人类游离脂肪酸结合蛋白(FABP6)的编码序列，下游为人类碱性成纤维细胞生长因子的编码序列，两个基因的编码区之间包含一段柔性接头编码序列，FABP6的氨基端包含His‑Tag标签编码序列。本发明专利技术提供了一种新型碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，其特点是：1)可溶性蛋白与包涵体蛋白的比值大于70％；2)容易借助组氨酸标签(His‑Tag)亲和纯化获得目标蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种可溶性细胞因子蛋白表达技术，尤其是涉及一种可溶性人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，属于分子生物学基因工程领域。
技术介绍
早在1940年，Hoftman等在脑和垂体的抽提物中发现一种能够促进成纤维细胞生长的物质。1974年该物质被分离纯化，并命名为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)。接着，人们又分离出一种与之高度同源的物质，由于它含有较多的酸性氨基酸碱基，等电点为酸性(pI＝5.6)，故命名为酸性FGF(aFGF)。先发现的FGF因对酸和热敏感，等电点偏碱(pI＝9.6)，则称为碱性FGF(bFGF)。aFGF和bFGF与后发现的int-2、FGF-5、角质细胞生长因子(KGF/FGF-7)、hst-1/kfgf、FGF-6等同属于FGF家族。随着bFGF的高度纯化(Bohlen，1984)、测序(Esch，1985，Simpson，1987)和DNA克隆成功(Araham，1986，Gospodarowicz，1984)引入肝素-琼脂糖亲和层析提纯bFGF，可得到90％以上纯度，从此bFGF的研究进入了新的阶段。bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的碱性蛋白质，其氨基酸序列与aFGF有55％的同源性，但其生物学活性比aFGF强30-100倍。bFGF分子量为16～18.5KD。bFGF分子结构中有4个半胱氨基酸(Cys)，用丝氨酸取代半胱氨酸，bFGF的生物学活性不变，更容易在大肠杆菌中表达。bFGF成熟肽的羧基端较氨基端更稳定，将氨基端截去24个氨基酸时，尚不影响其生物学活性。bFGF在生物进化上具有很强的保守性，人和牛的bFGF蛋白同源性达98.7％。bFGF主要分布于脑垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、胎盘等部位，以垂体组织含量最高，每公斤垂体组织可纯化bFGF 0.5mg，其它组织含量很少，约为其1/10～1/50。bFGF不存在或以极低浓度存在于血清和体液中。bFGF作为细胞分裂原，主要作用在起源于中胚层和神经外胚层的骨骼肌细胞、成纤维细胞和骨细胞等，其受体也相应的分布于上述细胞表面。FGF存在两类受体：一类是亲和力受体，属跨膜性酪氨酸蛋白激酶类受体；另一类是低亲和力受体，即肝素样受体，为硫酸乙酰肝素蛋白多糖类物质。bFGF通过与靶细胞上的受体结合而发生作用，因此细胞内合成的bFGF需分泌至细胞外才能发挥生物学效应。但bFGF的mRNA翻译产物缺少引导它们向细胞外分泌的信号序列，其
分泌途径与经典途径不同，除了可能是细胞受损或死亡后释出，还有自分泌和旁分泌起作用。bFGF与受体结合后，能通过以下途径将信号传导到细胞核，从而调控基因表达：(1)激活腺苷酸环化酶与鸟苷酸环化酶，磷脂酶C(PLC-rl)磷酸化，又使磷脂酰肌醇-4，5二磷酸(PIP2)分解为甘油二酯(DG)和三磷酸肌醇(IP3)，导致蛋白激酶C激活和Ca2+内流；(2)与受体结合后定位于细胞核，影响RNA聚合酶Ⅰ，加强核蛋白体基因的转录，以加速细胞由G0→G1和→G1→S期的转换，刺激细胞的DNA合成增强，促进细胞的分裂与增殖；(3)bFGF与FGFR复合物的内部化。现今资料表明，bFGF的生物学作用极其广泛，它在组织修复、促进创伤愈合与血管形成、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。bFGF的生物学效应分体内和体外两大部分。体外作用十分强烈，成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。体外细胞培养中能在低浓度(1mg·ml－1)发挥其作用。bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子。其主要生物学作用有：(1)作为血管生长因子；(2)促进创伤愈合与组织修复；(3)促进组织再生；(4)参与神经再生等。bFGF在体内含量甚微，但分布广泛，生理功能复杂多样。bFGF生物活性的多效性以及神经营养的广谱性，为其从基础走向临床提供了保证。在皮肤衰老的修复和预防皮肤衰老的研究中，神经-体液因子的联合营养调控早已得到认证。肢体神经损伤，肢体萎缩；皮肤神经末稍萎缩或功能异常，皮肤松弛，感觉迟钝，营养障碍，出现神经性皮炎、色素沉着、色斑、或老年斑。皮肤表面的临床使用证明，少量的吸收(毛囊或汗腺口)，经过一段时间后，皮肤质感丰实，皱纹减少、沟纹变浅。这些发现使得bFGF在日用护肤抗衰领域拓开了巨大的应用前景。目前，国际日化名牌极少有bFGF的添加，添加表皮生长因子(EGF)的居多，EGF使表皮新生、眼观嫩丽，但对深层结缔组织作用较弱，修复能力不够，配合bFGF联合应用，将形成全方位皮肤抗衰调控，由内向外、由里及表的全层维持细胞与组织的优良状态；不仅表皮代谢旺盛、皮下成纤维细跑合成和更新胶原蛋白过程也加强，皮肤的血液供应改善，神经末稍功能得以适当维护，神经-体液的双重营养得到提高，这将是医学生理学需要的全方位仿生生物学皮肤抗衰老科学。随着bFGF在医药和日化领域的应用市场扩大，对bFGF的需求量快速上升，目前常见的原核细胞bFGF基因表达工程获得的bFGF因子，可溶性低，包涵体多，经常借助体外复性，造成产量低、活性低、工艺繁，不利于大工艺生产。
技术实现思路
鉴于以上bFGF的生产与应用问题，本专利技术的目的在于提供一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。本专利技术的另一目的在于提供一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，以提高可溶性bFGF的表达产量。本专利技术的又一目的在于提供上述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的应用。本专利技术通过以下技术方案得以实现：一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白质：(1)由脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白融合得到的融合蛋白；所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABP1～FABP9中的任意一种或亚种，所述FABP1～FABP9的氨基酸序列如下所示：所述的FABP1为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；所述的FABP1-1为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；所述的FABP1-2为氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；所述的FABP2为氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；所述的FABP3为氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白质；所述的FABP4为氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的蛋白质；所述的FABP5为氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的蛋白质；所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID NO：8第2～127位氨基酸残基所示的蛋白质；所述的FABP7为氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的蛋白质；所述的FABP8为氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的蛋白质；所述的FABP9为氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的蛋白质；或者，为将SEQ ID NO：1～11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；所述碱性成纤维细胞生长因子蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的蛋白质，或者为将SEQ ID NO：12所示的氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于是如下(1)或(2)的蛋白质：(1)由脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白融合得到的融合蛋白；所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABP1～FABP9中的任意一种或亚种，所述FABP1～FABP9的氨基酸序列如下所示：所述的FABP1为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；所述的FABP1‑1为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；所述的FABP1‑2为氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；所述的FABP2为氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；所述的FABP3为氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白质；所述的FABP4为氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的蛋白质；所述的FABP5为氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的蛋白质；所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID NO：8第2～127位氨基酸残基所示的蛋白质；所述的FABP7为氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的蛋白质；所述的FABP8为氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的蛋白质；所述的FABP9为氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的蛋白质；或者，为将SEQ ID NO：1～11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；所述碱性成纤维细胞生长因子蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的蛋白质，或者为将SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；所述的脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白通过柔性接头连接；(2)将(1)的N端连接组氨酸标签得到带标签融合蛋白。...
【技术特征摘要】
1.一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于是如下(1)或(2)的蛋白质：(1)由脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白融合得到的融合蛋白；所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABP1～FABP9中的任意一种或亚种，所述FABP1～FABP9的氨基酸序列如下所示：所述的FABP1为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；所述的FABP1-1为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；所述的FABP1-2为氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；所述的FABP2为氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；所述的FABP3为氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白质；所述的FABP4为氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的蛋白质；所述的FABP5为氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的蛋白质；所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID NO：8第2～127位氨基酸残基所示的蛋白质；所述的FABP7为氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的蛋白质；所述的FABP8为氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的蛋白质；所述的FABP9为氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的蛋白质；或者，为将SEQ ID NO：1～11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；所述碱性成纤维细胞生长因子蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的蛋白质，或者为将SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；所述的脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白通过柔性接头连接；(2)将(1)的N...
【专利技术属性】
技术研发人员：李万波，陕婧婧，卢婵，
申请(专利权)人：盘古基因生物工程南京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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