一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，在培养皿底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形区域内，于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼脂糖/海藻酸钠混合溶液加到该环形区域，溶液固化后，加CaCl2溶液钙化，再加入壳聚糖溶液反应，在干细胞上形成一层琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶。在复合凝胶表面接种诱导细胞。本发明专利技术诱导细胞和干细胞共培养可模拟体内细胞之间及细胞和可溶性因子之间的相互作用，多糖基的琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶则可模拟体内细胞外基质，其刚度和厚度可调控干细胞的定向分化，同时实现了干细胞和诱导细胞的隔离共培养，使得分化细胞容易收获，将在再生医学应用中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，在培养皿底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形区域内，于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼脂糖/海藻酸钠混合溶液加到该环形区域，溶液固化后，加CaCl2溶液钙化，再加入壳聚糖溶液反应，在干细胞上形成一层琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶。在复合凝胶表面接种诱导细胞。本专利技术诱导细胞和干细胞共培养可模拟体内细胞之间及细胞和可溶性因子之间的相互作用，多糖基的琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶则可模拟体内细胞外基质，其刚度和厚度可调控干细胞的定向分化，同时实现了干细胞和诱导细胞的隔离共培养，使得分化细胞容易收获，将在再生医学应用中发挥重要作用。【专利说明】
本专利技术涉及再生医学领域，是。
技术介绍
干细胞由于具有自我更新和向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨或脂肪等多种类型细胞分化的能力，是再生医学的理想种子细胞。但是由于干细胞自发分化具有不可控性，当干细胞植入体内受损组织后，干细胞除了分化为所需要的细胞类型，参与组织修复，同时也分化为其它类型的细胞，甚至具有较高的致瘤性。对干细胞进行体外预分化，使之在移植之前预先分化为所需类型细胞或其前体细胞，能够提高定向分化效率，减低干细胞在体内向其它类型细胞分化的能力，从而提高修复效果，降低致瘤风险。 目前，体外诱导干细胞定向分化的方法包括生长因子组合/化学试剂诱导以及细胞共培养诱导。大量研究表明高剂量的生长因子组合或者化学试剂尽管能够刺激干细胞产生目的细胞的表型，但是所获得分化细胞缺乏长期的生理功能，并且容易引发细胞变异，因此此种方法存在有效性和安全性方面的问题。细胞共培养是使用具有目的细胞表型的诱导细胞和干细胞进行体外共培养，此种方法可以模拟体内特异组织细胞微环境，所获得的分化细胞具有接近体内特异组织细胞的生理功能，具有临床应用潜力。 体内细胞微环境主要构成要素有细胞和细胞、细胞和细胞外基质以及细胞和可溶性因子之间的相互作用。研究表明可溶性因子的种类和浓度、细胞外基质的成分和刚度均对干细胞的定向分化均有重要的调控作用，因此体外细胞共培养体系的设计应考虑到这些要素对分化的协同影响。目前常用的共培养体系包括直接接触共培养以及Transwell共培养体系。直接接触共培养体系将诱导细胞和干细胞进行混合培养，尽管此体系较为接近体内细胞微环境，但是诱导细胞和干细胞相互污染，不能应用于临床。Transwell共培养体系尽管利用多孔平板膜将两种细胞隔开，避免了细胞分离问题，体现了细胞和细胞之间、细胞和因子之间的相互作用，但是缺乏细胞外基质成分和刚度的影响，并且不能调整可溶性因子在两种细胞之间的浓度分布，因而限制了干细胞分化效率以及分化细胞功能水平的提高,并且此体系价格昂贵,使得实验成本大大增加。 由于现有细胞共培养体系存在上述主要缺陷，严重限制了干细胞体外定向分化技术的进一步发展与应用，因此急需研发便捷实用的可多角度模拟体内细胞微环境中细胞之间、细胞和细胞外基质之间以及细胞和可溶性因子之间相互作用的体外细胞共培养新方法，以实现体外对干细胞体外定向预分化的调控，进一步促进干细胞在再生医学领域的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，即利用琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶实现诱导细胞和干细胞的非接触共培养，通过改变平板复合凝胶的刚度和厚度可调控干细胞的定向分化，同时实现不同类型细胞之间的分离，以获得纯净的分化细胞。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为: 在培养皿底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形垫片所形成的环形区域之内，置于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼脂糖/海藻酸钠混合溶液加到该环形区域，使混合溶液液面高度超过垫片厚度2_。之后于环形垫片上平铺一个玻璃板，将玻璃板紧密压在垫片之上，待环形垫片内的混合溶液固化后，揭去玻璃板，加入CaCl2溶液进行钙化，之后加入壳聚糖溶液进行反应，从而在干细胞之上形成了一层琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶。然后在平板复合凝胶表面接种诱导细胞，从而在同一个培养体系中实现了干细胞和诱导细胞的非接触共培养，通过改变琼脂糖/海藻酸钠混合溶液中琼脂糖的质量浓度以及环形垫片的厚度可改变平板复合凝胶的刚度、厚度以及诱导细胞分泌的可溶性因子在复合凝胶中的浓度，进而调控干细胞的体外定向分化。 所述环形垫片包括金属垫片或非金属垫片，其厚度为10-3000 μ m。 所述干细胞包括胚胎干细胞、iPS细胞、间充质干细胞、神经干细胞、虹膜色素上皮细胞、羊膜上皮细胞、或造血干细胞，诱导细胞包括分离培养的体细胞或细胞系； 干细胞和诱导细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞； 调控干细胞向神经细胞分化的诱导细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、髓鞘细胞、或神经组织来源的肿瘤细胞系； 调控干细胞向心肌细胞分化的诱导细胞包括；原代心肌细胞或心肌细胞系； 调控干细胞向肝细胞分化的诱导细胞包括原代肝实质细胞、原代内皮细胞、内皮细胞系、肝星状细胞、成纤维细胞、3T3细胞系、或肝组织来源的肿瘤细胞系； 调控干细胞向胰岛细胞分化的诱导细胞包括原代胰岛或胰岛细胞； 调控干细胞向成骨细胞分化的诱导细胞包括原代成骨细胞或骨组织来源的肿瘤细胞系； 调控干细胞向软骨细胞分化的诱导细胞包括原代软骨细胞或软骨细胞系； 调控干细胞向脂肪细胞分化的诱导细胞为原代脂肪细胞。 所述琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶为由琼脂糖、海藻酸钠和壳聚糖所制备； 琼脂糖为I型，电内渗值小于0.2 ； 海藻酸钠的分子量为10-1OOOkDa,古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)为 0.2-3，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠； 壳聚糖分子量为2_200kDa，脱乙酰度为50_100%，所使用的溶液浓度为 0.02-0.5%(ff/V)。 所述琼脂糖/海藻酸钠混合溶液中琼脂糖质量浓度为0.1-6%(W/V)，海藻酸钠质量浓度为0.1-3% (W/V)。 所使用的琼脂糖/海藻酸钠混合溶液、10mmol.IZ1CaCl2溶液以及壳聚糖溶液的体积比为1:10:5。 所述改变平板复合凝胶的刚度为通过改变琼脂糖的质量浓度来实现，其刚度为0.2kPa_80kPa。 所述改变平板复合凝胶的厚度为通过改变环形垫片的厚度来实现，其厚度为10-3000 μ mD 所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪组织的细胞定向分化。 本专利技术具有如下优点: 1.操作简单，成本低。本专利技术利用琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶作为干细胞和诱导细胞共培养的隔离手段，制备简单，避免使用昂贵材料和工艺； 2.很好地模拟体内特异组织分化微环境，提高干细胞分化效率。借助于诱导细胞和复合凝胶，本专利技术较好地模拟了体内组织成熟细胞和干细胞之间，干细胞和可溶性因子之间以及细胞和细胞外基质之间的相互作用，从而在体外实现了干细胞在近似体内组织环境中的定向分化，除了分化效果的提高，还避免了有毒性化学诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，其特征在于：在培养皿底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形垫片所形成的环形区域之内，置于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼脂糖/海藻酸钠混合溶液加到该环形区域，使混合溶液液面高度超过垫片厚度大于或等于2mm；之后于环形垫片上平铺一个玻璃板，将玻璃板紧密压在垫片之上，待环形垫片内的混合溶液固化后，揭去玻璃板，加入CaCl2溶液进行钙化，之后加入壳聚糖溶液进行反应，从而在干细胞之上形成了一层琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶；然后在平板复合凝胶表面接种诱导细胞，从而在同一个培养体系中实现了干细胞和诱导细胞的非接触共培养，通过改变琼脂糖/海藻酸钠混合溶液中琼脂糖的质量浓度以及环形垫片的厚度可改变平板复合凝胶的刚度、厚度以及诱导细胞分泌的可溶性因子在复合凝胶中的浓度，进而调控干细胞的体外定向分化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马小军，刘洋，连建春，孙广炜，贺欣，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21