一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了诱导人胎盘绒膜间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，包括以下步骤：将三维材料和聚胶溶液混合，在37℃聚胶30分钟；再加入人胎盘绒膜间充质干细胞，于37℃，5%CO

Method for inducing human placenta chorion mesenchymal stem cells to differentiate into neural like stem cells

The present invention discloses induced human placental chorionic mesenchymal stem cells to differentiate into cells of the three-dimensional culture method of neural stem, which comprises the following steps: three-dimensional materials and polymer binder mixing solution at 37 DEG C of polymer and 30 minutes; adding human placenta chorionic mesenchymal stem cells, at the temperature of 37, 5%CO

【技术实现步骤摘要】
一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法
本专利技术涉及一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，具体涉及一种无化学诱导因子的人胎盘绒膜间充质干细胞三维培养方法分化为神经样干细胞的方法。
技术介绍
神经样干细胞(neuralstemcell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡不能再生。这种观点使人们对中枢神经系统疾病的治疗受到了很大限制。虽然传统的药物、手术及康复治疗取得了一定的进展，但是仍不能达到满意的效果。神经样干细胞的发现，解决传统药物治疗固有的缺点，神经样干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。该疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。三维培养指在一定的环境条件下，将细胞种植在三维支架中，构建出具有特定形态和功能细胞的方法。三维球状形态（或者克隆形态）与干细胞特性密切相关，如胚胎干细胞在滋养层上以克隆形态生长，神经样干细胞以神经球的形态生长；克隆形成实验是鉴定干细胞的重要手段，干细胞分化后失去克隆样形态；多项研究也表明三维培养可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性。目前，三维培养在诱导间充质干细胞向软骨细胞或肝样细胞等分化中有报道。但是，由于每种细胞的特性不同，尚没有可以通用的培养方式，且目前还没有利用三维培养诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的相关报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，所述方法无化学诱导因子加入，解决了现有神经细胞无法再生的问题。本专利技术采用如下技术方案：一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，包括以下步骤：（1）人胎盘绒膜间充质干细胞的获得；（2）三维材料的聚焦，将三维材料和聚胶溶液混合，在37℃聚胶30分钟；（3）细胞的分化及培养，加入人胎盘绒膜间充质干细胞，于37℃，5%CO2培养，隔日更换培养液。所述聚胶溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液。进一步的，所述I型胶原溶液的浓度为3mg/mL，所述聚乳酸溶液的浓度为2.5mg/mL；所述丝素蛋白溶液的浓度为5mg/mL。步骤（4）中所述细胞的分化与培养时间为14天。步骤（4）中加入的人胎盘绒膜间充质干细胞的浓度为5×105cells/孔。所述有益效果：1、本专利技术所述诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，不依赖基因、RNA及蛋白的导入，更易于诱导分化成熟；无化学诱导因子的作用，分化后神经样干细胞可直接用于后续临床试验，更安全；2、利用三维培养技术为神经分化提供一种体内样的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长，同时可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性；3、胎盘绒膜来源的干细胞可跨胚层分化为神经样干细胞，无任何伦理问题，细胞增殖能力强。附图说明图1为人胎盘绒膜间充质干细胞及诱导分化后的神经样干细胞形态图。图A为人胎盘绒膜间充质干细胞形态图，图B为诱导分化7天后神经样干细胞形态图，图C为诱导分化14后神经样干细胞形态图，比例尺50um。图2为荧光定量PCR检测基因相对表达水平图。左侧柱形图表示对照人胎盘绒膜间充质干细胞的表达水平，中间柱形图表示诱导分化7天后神经样干细胞的相对表达水平，右侧柱形图表示诱导分化14天后神经样干细胞的相对表达水平。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施方式做进一步说明。本领域的公知常识、常用的物质检测、鉴定方法等，因是本领域技术人员所熟知的，本专利技术未一一赘述。本专利技术中使用的各种试剂都是市售试剂。实施例1（1）获得离体人胎盘绒膜来源的间充质干细胞。取5g胎盘绒膜组织，用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，得到边长小于3毫米的组织块。将所得组织块收集于15ml离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静至5分钟，待组织块分为两层后小心收集上层部分，收集的上层部分组织块使用磷酸盐缓冲液洗涤3遍；向收集的上层组织块中加入等体积的0.075%的胶原酶I，37℃水浴30min；加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，充分混匀后室温静至10min分层；去掉上层（脂质/碎片），20℃，280g离心5min收集下层部分细胞（基质血管部分、干细胞、红细胞）；裂解红细胞，将收集的下层部分细胞使用160mMNH4Cl重悬3min，使用40μm滤膜过滤，将滤液加入到含5mLDMEM，10%FBS的离心管中；20℃，280g离心5min收集细胞，并于1%青霉素/链霉素、10%FBS的DMEM培养基中培养，即获得人胎盘绒膜间充质干细胞。（2）诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样干细胞的分化。I型胶原溶液的配制(3mg/mL)：称取30mgI型胶原，溶于无菌预冷的8mLNaOH溶液，于冰上混匀，使用无菌预冷的dH2O定容为10mL。三维材料的聚胶:将制备好的3mg/mLI型胶原加入到含有三维材料的12孔培养板中，25μL/孔，37°C培养箱中聚胶30min，即可得到多孔的已聚胶的I型胶原三维支架。在已聚胶的I型胶原三维支架上加入混匀的人胎盘绒膜间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×105cells/孔。加入人胎盘绒膜间充质干细胞培养液500ul（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO2进行培养，隔日换液。（3）获得神经样干细胞。于倒置显微镜下观察细胞形态的变化，结果见图1。左图中人胎盘绒膜间充质干细胞呈纤维状，中图为诱导分化7天后细胞形态图，细胞变圆；右图为诱导分化14后细胞形态图，细胞呈典型的神经样干细胞形态。实施例2（1）获得离体人胎盘绒膜来源的间充质干细胞：同实施例1。（2）诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样干细胞的分化。三维支架的聚胶:将2.5mg/mL聚乳酸溶液加入到含有三维材料的12孔培养板中，25μL/孔，37°C培养箱中聚胶30min，即可得到多孔的已聚胶的三维支架。在已聚胶的三维支架上加入混匀的人胎盘绒膜间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×105cells/孔。加入人胎盘绒膜间充质干细胞培养液500ul（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO2进行培养，隔日更换培养液。（3）获得神经样干细胞。实施例3（1）获得离体人胎盘绒膜来源的间充质干细胞：同实施例1。（2）诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样干细胞的分化。三维支架的聚胶:将5mg/mL丝素蛋白溶液加入到含有三维材料的12孔培养板中，25μL/孔，37°C培养箱中聚胶30min，即可得到多孔的已聚胶的三维支架。在已聚胶的三维支架上加入混匀的人胎盘绒膜间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×105cells/孔。加入人胎盘绒膜间充质干细胞培养液500ul（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO2进行培养，隔日换培养液。（3）获得神经样干细胞。实施例4荧光定量聚合酶反应（Realtime-PCR）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，包括以下步骤：（1）    人胎盘绒膜间充质干细胞的获得；（2）    三维材料的聚胶，将三维材料和聚胶溶液混合 ，在37℃孵育30分钟，完成聚胶；（3）    细胞的分化及培养，加入人胎盘绒膜间充质干细胞，于37℃，5%CO

【技术特征摘要】
1.一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，包括以下步骤：（1）人胎盘绒膜间充质干细胞的获得；（2）三维材料的聚胶，将三维材料和聚胶溶液混合，在37℃孵育30分钟，完成聚胶；（3）细胞的分化及培养，加入人胎盘绒膜间充质干细胞，于37℃，5%CO2培养，隔日更换培养液。2.根据权利要求1所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的聚焦溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液中的一种。3.根据权利要求2所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：所述I型胶原溶液的浓度为3m...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯文峰，黄鹏，昌芒，
申请(专利权)人：广州思丹福生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44