大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法技术

本发明专利技术公开了一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，骨髓间充质干细胞(MSCs)按20000个/ml密度接种，用Neurobasal medium和B27supplement为基础培养基，加入细胞因子SHH(250ng/ml)，FGF‑8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)联合0.5μM LXR激动剂(T0901317)共同诱导6天。本发明专利技术方法提高大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞分化的效率，并缩短诱导时间。

Optimization of differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into dopaminergic neurons

The invention discloses a rat bone marrow mesenchymal stem cells to optimize the method of differentiation into dopaminergic neurons, bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in 20000 /ml Neurobasal density inoculation, medium and B27supplement as basic medium with cytokines of SHH (250ng/ml), FGF 8 (100ng/ml) bFGF, (50ng/ml) combined with 0.5 M LXR agonist (T0901317) induced by 6 days. The method of the invention improves the efficiency of the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron like cells, and shortens the induction time.

【技术实现步骤摘要】
大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法
本申请属于生物医学
，涉及干细胞定向诱导分化领域，具体涉及一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法。
技术介绍
帕金森病(Parkinson’sdisease，简称PD)是常见于老年人的神经系统退行性疾病，其发病率仅次于阿尔兹海默病，位于第二位。一直是临床治疗的难点。目前认为其主要病因为脑中多巴胺能神经元的退行性变，大脑的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的药物和手术疗法能缓解疾病的早期临床症状，但无法阻止或逆转多巴胺能神经元退行性变，而且长期使用有明显的副作用。干细胞的发现以及体外诱导分化为神经细胞的成功使得细胞移植替代治疗成为可能。干细胞治疗需要合适的种子细胞，并把种子细胞培养获得适合移植使用的目标细胞，即多巴胺能神经元样细胞。目前认为可能用于PD治疗的干细胞来源包括胚胎干细胞(embryonicstemcells，简称ESCs)，神经干细胞(Neuralstemcells，简称NSCs)，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，简称MSCs)等。胚胎干细胞体外向多巴胺能神经元分化已有报道(Buytaert-HoefenKA,AlvarezE,andFreedCR.GenerationoftyrosinehydroxylasepositiveneuronsfromhumanembryonicstemcellsaftercoculturewithcellularsubstratesandexposuretoGDNF.StemCells,2004.22(5):p.669-74.)。但是胚胎干细胞一般是来自于异源性组织的细胞，有免疫排斥的风险，并且伦理学争议较多。神经干细胞，一般是来自于胚脑神经组织得到的，体外也可分化为大脑中几乎所有类型的神经元，包括多巴胺能神经元(LieDC,etal.Theadultsubstantianigracontainsprogenitorcellswithneurogenicpotential.JNeurosci,2002.22(15):p.6639-49.)。但是神经干细胞相比胚胎干细胞分化潜能低，单一谱系方向分化效率也较低，同时来源有限，且有伦理学争议。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外一定条件下可向神经细胞进行分化。并且骨髓间充质干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化、又可进行自体移植等特点，被认为是帕金森病等神经退行性疾病细胞替代疗法的理想来源。目前体外诱导的方法主要分为3种：①神经营养因子和细胞因子，如维甲酸、脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等诱导分化。②化学试剂，二甲基亚砜、2-巯基乙醇、丁羟茴醚等诱导分化。③基因转染或修饰的诱导分化。全骨髓培养得到的MSCs在体外合适条件和诱导因子作用12天可分化为表达多巴胺神经元标记物酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，简称TH)的神经元样细胞，并具有一定的电生理活性，分化效率可达67％，是目前骨髓间充质干细胞能达到的最大分化率以及最短的诱导时间(TrzaskaKA,KuzhikandathilEV,RameshwarP,Specificationofadopaminergicphenotypefromadulthumanmesenchymalstemcells.StemCells,2007.25(11):p.2797-808.)。然而，目前技术难以通过体外诱导分化得到足够数量的成熟多巴胺能神经元，而且移植后的细胞存活数量有限、移植细胞不易与原有神经网络融合都在一定程度上限制了其临床应用。因此，在细胞替代治疗帕金森病，提高骨髓间充质干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的分化效率是解决这些问题的关键。肝X受体(LiverXreceptor，LXR)是核受体家族中重要的一员，有α和β两种亚型，LXRα除在肝脏高表达外，也在脂肪组织、肾、小肠、肺、肾上腺及巨噬细胞表达；LXRβ几乎在所有的组织和器官内表达，尤其在脑。近年研究发现LXR在中枢神经系统中有重要功能，包括参与皮质板层神经元发育、维持运动神经元的存活、调节脂代谢、调节神经免疫以及参与突触可塑性和轴突形成等多种生理功能。LXRα/β基因双敲除小鼠显示脂质在脑内逐渐累积，以及脊髓运动神经元和腹侧中脑多巴胺能神经元的丢失(SacchettiP,etal.LiverXreceptorsandoxysterolspromoteventralmidbrainneurogenesisinvivoandinhumanembryonicstemcells.cellStemCell,2009.5(4):p.409-19.)然而，迄今未见有关LXR激动剂对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元方向分化影响的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本申请针对上述存在的问题，提供了一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法。为了解决上述技术问题，本申请公开了一种大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，骨髓间充质干细胞(MSCs)按20000个/ml密度接种，用Neurobasalmedium和B27supplement为基础培养基，加入细胞因子SHH(250ng/ml)，FGF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)联合0.5μMLXR激动剂(T0901317)共同诱导6天。与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：1)肝X受体作为靶点参与多巴胺能神经元的诱导分化及其机制。2)肝X受体激动剂联合细胞因子SHH、FGF-8、bFGF可诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向多巴胺能神经元分化，提高了诱导分化率，并缩短了诱导时间，产生协同作用。3)肝X受体激动剂与其他诱导方法(如：化学试剂诱导，基因转染，其他细胞因子等)联用,可能促进诱导干细胞(如：胚胎干细胞、神经干细胞、脐带间充质干细胞等)向多巴胺能神经元的诱导，分化与成熟。当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为倒置相差显微镜观察原代和传代培养后的骨髓间充质干细胞(10×20)；其中(a)：原代培养；(b)：传代培养后细胞呈典型的长梭形，漩涡状生长；图2为流式细胞仪检测克隆化培养后的骨髓间充质干细胞表面标记物的流式图；图3为倒置相差显微镜观察诱导后的骨髓间充质干细胞(10×20)；其中(a)：对照组细胞呈长梭形；(b)：处理组细胞胞体聚拢，并有突起；(c)：LXR组细胞胞体聚拢，并有突起；图4为免疫荧光检测诱导后多巴胺能神经元相关标记物Nestin的表达(×400)；其中(a)：对照组无神经标记物Nestin阳性表达；(b)与(c)：处理组和LXR组均有神经标记物Nestin阳性表达(红色)；图5为免疫荧光检测诱导后多巴胺能神经元相关标记物Tuj1/TH的表达(×200)；其中(a)：对照组无多巴胺能神经元相关标记物Tuj1/TH阳性表达；(b)与(c)：处理组和LXR组均有多巴胺能神经元相关标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞按20000个/ml密度接种，用Neurobasal medium和B27supplement为基础培养基，加入细胞因子SHH、FGF‑8、bFGF联合LXR激动剂共同诱导6天。

【技术特征摘要】
1.大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞按20000个/ml密度接种，用Neurobasalmedium和B27supplement为基础培养基，加入细胞因子SHH、FGF-8、bFGF联合LXR激动剂共同诱导6天。2.如权利要求1所述的大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，其特征在于，音速波状蛋白(sonichedgehog,SHH)的浓度为250ng/ml。3.如权利要求1所述的大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的优化方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊卿，田小燕，承欧梅，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50