膜微粒的制备及其在预防和治疗电离辐射导致的造血系统损伤和促进红系细胞分化中的应用技术方案

本发明专利技术涉及一种预防及治疗电离辐射导致的造血系统损伤及诱导造血细胞红系分化的新方法。本发明专利技术还涉及制备可用于该新方法的膜微粒的方法，其包括采用聚乙二醇(PEG)处理细胞培养物上清中的膜微粒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于电离辐射导致的造血系统损伤的预防及治疗领域。更具体而言，本专利技术涉及制备膜微粒的方法以及膜颗粒在预防或治疗电离辐射导致的造血系统损伤以及促进红系细胞分化中的应用。
技术介绍
电离辐射是由直接或间接电离粒子使受作用物质发生电离现象的辐射。电离辐射对机体的损伤可分为急性放射损伤和慢性放射损伤。机体大部分或全身短时间内暴露于相对高剂量辐射(对于人体高于1Gy)可引起机体的急性损伤。急性损伤平时见于核事故和放射治疗病人，通常称作放射病(radiationsickness)或急性放射综合征(acuteradiationsyndrome，ARS)。相对快速增殖的细胞及相应组织和器官易感辐射损伤。包括皮肤、造血系统、胃肠道系统、血管系统、生殖系统等在内的几乎所有器官、系统均易发生病理改变，其中以神经系统、造血系统和消化系统的改变最为明显。而较长时间内分散接受一定剂量的照射，可引起慢性放射性损伤，如皮肤损伤、造血障碍、白细胞减少、生育力受损等。另外，辐射还可以致癌和引起胎儿的死亡和畸形。临床上用于预防或减轻辐射损伤的方法包括采用辐射防护剂、辐射缓解剂或辐射后治疗刺激组织再生[Bentzen,S.M.Preventingorreducinglatesideeffectsofradiationtherapy:radiobiologymeetsmolecularpathology.Nat.Rev.Cancer2006,6,702-713.Coleman,C.N.；Stone,H.B.；Moulder,J.E.；Pellmar,T.C.Medicine.Modulationofradiationinjury.Science2004,304,693-694.Whitnall,M.H.；Pellmar,T.C.In:Newdirectionsindevelopmentofpharmacologicalcountermeasuresfortheacuteradiationsyndrome；ResearchSignpost:Trivandrum,India,2007.Chao,N.J.Accidentalorintentionalexposuretoionizingradiation:biodosimetryandtreatmentoptions.Exp.Hematol.2007,35,24-27.Waselenko,J.K.；MacVittie,T.J.；Blakely,W.F.；Pesik,N.；Wiley,A.L.；Dickerson,W.E.；Tsu,H.；Confer,D.L.；Coleman,C.N.；Seed,T.；Lowry,P.；Armitage,J.O.；Dainiak,N.Medicalmanagementoftheacuteradiationsyndrome:recommendationsoftheStrategicNationalStockpileRadiationWorkingGroup.Ann.Intern.Med.2004,140,1037-1051.]。然而，迄今仍无批准用于治疗ARS的药物。挽救造血衰竭是电离辐射损伤的关键治疗策略之一，包括采用造血生长因子或造血干细胞移植[SahaS,BhanjaP,KabarritiR,LiuL,AlfieriAA,GuhaC.BoneMarrowStromalCellTransplantationMitigatesRadiation-InducedGastrointestinalSyndromeinMice.PLoSOne2011；6:e24072.]，但后者受制于合适供者的可获取性。在再生疗法和免疫治疗的大背景下，间充质干细胞(mesenchymalstem/stromalcell，MSC)的治疗潜力及安全性被广为研究。已经有大量报道采用MSC用于各种临床试验及研究[Lalu,M.M.,McIntyre,L.,Pugliese,C.,etal.(2012).Safetyofcelltherapywithmesenchymalstromalcells(SafeCell):asystematicreviewandmeta-analysisofclinicaltrials.PloSOne,7,e47559.]。总的来看，MSC可通过其旁分泌机制发挥有益的治疗作用，其核心机制在于包含生物活性成分的膜微粒或微泡(microvesicle(MV)，也称为外泌体(exosome)或微颗粒(microparticle))。MV包括来自于胞内内涵体(endosome)的外泌体(exosome)以及来自于细胞质膜的脱落囊泡，前者大小一般为40～100nm，后者大小一般为100nm～1um。MV可通过表面受体相互作用以及转移传递蛋白、mRNA和miRNA等参与细胞间通讯和调节靶细胞活动，包括血管生成[Lee,J.K.,Park,S.R.,Jung,B.K.,etal.(2013).ExosomesderivedfrommesenchymalstemcellssuppressangiogenesisbydownregulatingVEGFexpressioninbreastcancercells.PloSOne,8,e84256.]、细胞增殖[Looze,C.,Yui,D.,Leung,L.,etal.(2009).ProteomicprofilingofhumanplasmaexosomesidentifiesPPARgammaasanexosomeassociatedprotein.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,378,433–438.]和免疫调节[Robbins,P.D.,&Morelli,A.E.(2014).Regulationofimmuneresponsesbyextracellularvesicles.NatureReviewsImmunology,14,195–208.]等。已有报道表明，MV可应用于急性肾损伤、心肌梗死、肝纤维化、肺动脉高压、后肢缺血、肿瘤生长抑制等[AkyurekliC,LeY,RichardsonRB,FergussonD,TayJ,AllanDS.Asystematicreviewofpreclinicalstudiesonthetherapeuticpotentialofmesenchymalstromalcell-derivedmicrovesicles.StemCellRev.2015,11(1):150-60.]。但迄今未有MV用于预防及治疗电离辐射损伤的报道。此外，现有膜微粒制备技术如超速离心技术(UC)、密度梯度离心技术(DGC)、高效液相色谱技术(HPLC)等均需要精密昂贵仪器设备，并且工艺步骤繁琐，有效处理体积极小，效率低下。因此，在本领域中，存在对于快速高效制备膜微粒的方法的需求。
技术实现思路
本专利技术人出人意料地发现，间充质干细胞(MSC)、尤其是脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstromal本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备膜微粒的方法，其包括采用聚乙二醇即PEG处理细胞培养物上清。

【技术特征摘要】
2015.12.30 CN 20151100564931.一种制备膜微粒的方法，其包括采用聚乙二醇即PEG处理细胞培养物上清。2.一种制备膜微粒的方法，所述方法包括以下步骤：a)收集细胞培养物上清；b)将所述培养物上清离心；c)收集并用聚乙二醇即PEG处理步骤b)中经离心的上清；d)离心步骤c)所获得的上清，并弃去经离心的上清，保留沉淀；e)用无血清培养基重悬沉淀，获得膜微粒。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞为间充质干细胞或成纤维细胞或造血细胞。4.根据权利要求2或3所述的方法，其在步骤a)之前进一步包括诱导细胞凋亡以释放膜微粒的步骤。5.根据权利要求4所述的方法，其中该诱导步骤包括在低氧低营养条件下培养所述间充质干细胞或成纤维细胞或造血细胞。6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其中在步骤b)和d)中各自独立地采用转速小于或等于10,000rpm的低速离心机进行离心。7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其中步骤b)和d)中各自独立地以2,000rpm至10,000rpm、2,500rpm至8,000rpm、2,600rpm至7,000rpm、2,700rpm至6,000rpm、2,800rpm至5,000rpm、2,900rpm至4,000rpm、或3,000rpm至3,500rpm的速度离心。8.根据权利要求2-7任一项所述的方法，其中步骤b)中在约4℃离心5-15分钟，和/或在步骤d)中在约4℃离心25-35分钟。9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其中所述PEG的分子量范围为2000-8000。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述PEG选自由下列组成的组：PEG8000、PEG7000、PEG600...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立生，周金武，张晓艳，王华，郭子宽，黄玉香，高宏，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，青岛奥克生物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11