一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法及装置，属于生物细胞工程神经再修复技术领域。包括以下步骤：1)取两根导电铜丝，固定于导电玻璃导电面的两端，固定后进行灭菌处理，备用；2)取新鲜离体肱骨，清洗后将骨髓间充质干细胞吸至离心管，离心去除上清液，加入培养基吹打均匀，再接种至培养瓶中，培养3～5代后备用；3)将步骤2)培养的细胞接种至步骤1)处理后的导电玻璃上，培养后，对细胞进行电刺激，通过免疫荧光染色和基因表达检测，得出细胞向神经元方向分化结果。采用对机体和细胞均无害的低频交流电，采用物理刺激的方法刺激干细胞，使其能够向神经方向分化；且此方法易操作，能随时给予电刺激，具有很高的可控性。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法及装置
本专利技术属于生物细胞工程神经再修复
，具体涉及一种诱导骨髓间充质干细胞神经分化及增殖的方法及装置。
技术介绍
神经损伤及神经退行性病变，尤其是中枢神经病变，可造成病灶区域大量神经元凋亡或死亡，被认为是目前临床上治疗的难点。既往尝试多种办法用于治疗此类疾病，但效果均不太理想。目前，细胞疗法作为一种重要的治疗方法，它的发展为神经损伤的修复带来了新的希望。干细胞作为细胞疗法的一个重要组成部分，因其具有多向分化潜能，能被诱导分化成神经细胞，而被越来越多的用于神经损伤的研究中。其中，骨髓间充质干细胞以其来源丰富、易取材、分化能力强等优点受到越来越多的关注。因此，如果将骨髓间充质干细胞诱导分化成神经细胞，那么将对神经损伤起到很好的治疗作用。现有技术中主要的促使干细胞向神经方向分化的方法为化学诱导法和神经营养因子诱导法，但这些诱导方法存在一定的局限性：1)诱导液不安全，细胞毒性大。化学诱导法是在培养基中加入适量的β-巯基乙醇，二甲基亚砜，丁基羟基茴香醚等物质，用以影响干细胞的分化，但这些试剂大多有强烈的细胞毒性作用，引起大量的细胞死亡。2)不易受控制：神经营养因子在诱导分化的过程中存在半衰期短，难以在体内长期保持活性等特点，因此该诱导方法具有一定的局限性。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法及装置，该方法操作简单，过程可控性强，能够有效完成骨髓间充质干细胞的神经分化和增殖；该装置结构设计合理，容易操作，易控制。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开了一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法，包括以下步骤：1)取两根导电铜丝，裁剪后用磨砂纸磨去铜丝两端，然后将两根导电铜丝用贴膜固定于导电玻璃导电面的两端，固定后进行灭菌处理，备用；2)取新鲜离体肱骨，用DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，然后将骨髓间充质干细胞吸至15mL离心管，离心，去除上清液，加入10％FBS的DMEM/F12培养基吹打均匀，再接种至培养瓶中，培养3～5代后备用；3)将步骤2)培养的细胞接种至步骤1)处理后的导电玻璃上，培养一天后，将导电铜丝接至电刺激仪上，对细胞进行电刺激，设置电刺激参数为1.5V/cm，频率为10Hz，然后在37℃恒温培养箱中连续刺激7天，每天1h，通过免疫荧光染色和基因表达检测，得出细胞向神经元方向分化结果。步骤2)所述的离心是在1200r/min下，处理8min。步骤2)所述接种至培养瓶中是按1×105个/瓶的浓度接种在底面积为25cm2的培养瓶中。接种至培养瓶中后，置于37℃、5％CO2浓度的湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液；随后每3天换液一次，待细胞融合度达80％后，用胰蛋白酶消化离心，按1：2或1：3的浓度传代，培养得到用于实验的细胞。步骤3)所述免疫荧光染色是检测神经元标志物MAP-2和/或β-tubulin；基因表达是检测神经元标志物MAP-2、β-tubulin或NF-200。所用导电玻璃尺寸为2.79cm×7.8cm。导电玻璃在使用前先用自来水清洗，再用去离子水清洗三遍，用吸水纸擦干后置于烘箱中，干燥20min，取出后室温冷却5min后备用。本专利技术还公开了实现上述方法的电刺激装置，包括培养槽及铺设在培养槽中的导电玻璃，在导电玻璃导电面的两端分别固定一根导电铜丝，两根导电铜丝的自由端与外接的电刺激仪相连；待诱导及分化的骨髓间充质干细胞置于导电玻璃的导电面上，且培养槽内填充培养基。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术公开的诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法，采用对机体和细胞均无害的低频交流电，采用物理刺激的方法刺激干细胞，使其能够向神经方向分化；且此种方法易于操作，能够随时给予电刺激，具有很高的可控性；同时，本专利技术应用此电刺激参数(电刺激1.5V/cm，频率10Hz)刺激骨髓间充质干细胞不仅能够降低细胞的死亡率，同时还能增加细胞增殖活性，所以本专利技术方法能够很好地应用在此类干细胞，有效解决现有神经诱导方法对细胞及机体有害、不易控制及分化率低的问题。本专利技术公开的诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的装置，结构设置合理，操作简单，安全性高，可控性强。附图说明图1为本专利技术的电刺激装置结构示意图；图2为骨髓间充质干细胞光镜图；图3为不同电刺激参数对细胞增殖活性的CCK-8吸光度值检测结果图；其中，(a)为刺激24h；(b)为刺激48h；(c)为刺激72h；图4为电刺激干细胞后的神经标志物MAP-2和β-tubulin的免疫荧光检测结果图；图5为本专利技术方法电刺激后干细胞的神经元标志物的基因表达结果图；其中，(a)为MAP-2；(b)为β-tubulin；(c)为NF200。具体实施方式下面结合具体的附图及实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。参见图1，本专利技术公开的一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的电刺激装置，包括培养槽5及铺设在培养槽5中的导电玻璃4，在导电玻璃4导电面的两端分别固定一根导电铜丝2，两根导电铜丝的自由端与外接的电刺激仪1相连；待诱导及分化的骨髓间充质干细胞3置于导电玻璃4的导电面上，且培养槽5内填充培养基6。1、实验材料：新鲜离体肱骨，采自3-6周龄的SD大鼠，由中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供。本专利技术公开的诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法，包括以下步骤：2、诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法，包括以下步骤：第一步，购买并清洗导电玻璃，导电玻璃尺寸：2.79×7.8cm。首先用自来水清洗导电玻璃，再用去离子水冲洗三遍，用吸水纸将其擦干后放入烤箱，烘烤20min，取出后室温冷却5min备用。第二步，将清洗干净并烘干的导电玻璃至于干净桌面，取两根导电铜丝，裁剪导电铜丝，用磨砂纸磨去铜丝两端，然后将两根导电铜丝用贴膜固定于导电玻璃导电面的两端，包装后对其进行灭菌处理。第三步，提取大鼠骨髓间充质干细胞，细胞提取前对细胞室和超净台进行紫外线照射杀菌，照射时间为2h，进细胞室前须戴无菌口罩、帽子、手术衣等。具体包括以下步骤：1)取新鲜离体股骨，用5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，吸至15ml离心管；将其放入离心机，设置1200r/min，离心8min，弃上清；用含10％胎牛血清的DMEM/DF12培养基重悬细胞，以1×l05个/cm2接种于25cm2培养瓶，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下，培养箱培养。2)培养48h后半量换液，以后每2天换液1次，细胞增殖、铺满至培养瓶底接近融合状态时，超净台内吸出培养基，加入0.25％胰蛋白酶消化液2ml，在室温下消化约5min，放于倒置显微镜下观察，发现细胞回缩，间隙变大时，说明细胞已经不再贴壁，将培养瓶放进超净台，加入三倍体积的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，并用弯头滴管轻柔吹打瓶壁，使其成细胞悬液，再将此悬液移至离心管中，放入离心机，以1200r/min的速度离心8min，取出后弃上清，用含10％胎牛血清的培养液重悬，再次以同样的转速和时间对其离心，弃上清，加入10％胎牛血清的培养基，待吹打成均匀的细胞悬液后，按1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导骨髓间充质干细胞神经分化及增值的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取两根导电铜丝，裁剪后用磨砂纸磨去铜丝两端，然后将两根导电铜丝用贴膜固定于导电玻璃导电面的两端，固定后进行灭菌处理，备用；2)取新鲜离体肱骨，用DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，然后将骨髓间充质干细胞吸至离心管，离心去除上清液，加入10％FBS的DMEM/F12培养基吹打均匀，再接种至培养瓶中，培养3～5代后备用；3)将步骤2)培养的细胞接种至步骤1)处理后的导电玻璃上，培养一天后，将导电铜丝接至电刺激仪上，对细胞进行电刺激，设置电刺激参数为1.5V/cm，频率为10Hz，然后在37℃恒温培养箱中连续刺激7天，每天1h，通过免疫荧光染色和基因表达检测，得出细胞向神经元方向分化结果。

【技术特征摘要】
1.一种诱导骨髓间充质干细胞神经分化及增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取两根导电铜丝，裁剪后用磨砂纸磨去铜丝两端，然后将两根导电铜丝用贴膜固定于导电玻璃导电面的两端，固定后进行灭菌处理，备用；所用导电玻璃尺寸为2.79cm×7.8cm；2)取新鲜离体肱骨，用DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，然后将骨髓间充质干细胞吸至离心管，离心去除上清液，加入10％FBS的DMEM/F12培养基吹打均匀，再接种至培养瓶中，培养3～5代后备用；3)将步骤2)培养的细胞接种至步骤1)处理后的导电玻璃上，培养一天后，将导电铜丝接至电刺激仪上，对细胞进行电刺激，设置电刺激参数为1.5V/cm，频率为10Hz，然后在37℃恒温培养箱中连续刺激7天，每天1h，通过免疫荧光染色和基因表达检测，得出细胞向神经元方向分化结果；所述免疫荧光染色是检测神经元标志物MAP-2和/或β-微管蛋白；基因表达是检测神经元标志物MAP-2、β-微管蛋白或NF-200。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄景辉，杨亚锋，罗卓荆，黄亮亮，马腾，朱雷，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61