一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒,其含有能特异性检测人成熟骨髓间充质干细胞的核酸适体。利用本发明专利技术的试剂盒，可以特异性的分离人成熟骨髓间充质干细胞，该试剂盒具有操作简单、方便直接用于人成熟骨髓间充质干细胞的分离，节约时间和成本。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及生物检测领域，具体涉及人成熟骨髓间充质干细胞的检测。
技术介绍
干细胞即为起源细胞。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力(Self-renewing)，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞是自我复制还是分化功能细胞，主要由于细胞本身的状态和微环境因素所决定。包括调节细胞周期的各种周期素(Cyclin)和周期素依赖激酶(Cyclin－DependentKinase)、基因转录因子、影响细胞不对称分裂的细胞质因子。微环境因素，包括干细胞与周围细胞，干细胞与外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。人体内的干细胞分两种类型，一种是全功能干细胞，可直接克隆人体；另一种是多功能干细胞，可直接复制各种脏器和修复组织。人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并最终通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗。最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。间充质干细胞(MSC,mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。骨髓间充质干细胞是来源于骨髓来源的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新我增殖能力以及向分化潜能。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。但是在现有技术中，鉴定时候筛选得到性能优良的骨髓间充质干细胞一直是一个难题。现有技术中CN104215773A公开了一种鉴定骨髓间充质干细胞活性的方法，其中首次发现了GAPDH蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达分布水平与骨髓间充质干细胞活性的关系，所提供的方法可以快速地鉴定出对疾病治疗效果好、增殖能力强的骨髓间充质干细胞，从而可用于骨髓间充质干细胞的高通量筛选。但是所述的鉴定方法需要鉴定GAPDH蛋白的水平，所述的鉴定一般需要制备GAPDH抗体，所述方法还是较为复杂，实际应用中成本很高，仍然不利于推广使用。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于快速鉴定对疾病治疗效果好、增殖能力强的骨髓间充质干细胞的试剂盒，以及相应的鉴定用的适配子。按照CN103421740A中公开的人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，获得成熟、活性高的人骨髓间充质干细胞，所述细胞为阳性表达:CD73，CD90，而阴性表达:CD34、CD45。本专利技术的目的是提供一种人骨髓间充质干细胞的核酸适配体序列。本专利技术中，所述的人骨髓间充质干细胞的核酸适配体(序列1-18)能够特异结合人骨髓间充质干细胞。本专利技术的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本专利技术中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性分离人骨髓间充质干细胞的试剂盒。从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。中筛选出与人骨髓间充质干细胞特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物F(5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’)和R(5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海生工生物公司)，转化DH5a细菌(购自上海生工生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。本专利技术采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以人骨髓间充质干细胞为正筛靶标，以人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充质干细胞为反筛靶标，筛选与人骨髓间充质干细胞特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合人骨髓间充质干细胞的序列，本专利技术中命名为适配体BMMSC-1～18。序列如下：本专利技术的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离人成熟的骨髓间充质干细胞，所述方法比采用GAPDH分离的方法具有分离成本低，时间更加简便等优点。本公开的适配子分子可用作将靶标结合或固定至固相载体的捕获试剂。固相载体可以由具有通常与过滤器、晶片、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组成的基底组成。然而，预期固相载体可由这样的基底组成，其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或任何用于捕获或固定用于诊断、检测或定量研宄的试剂的诊断性检测试剂。固相载体可以基于所需的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金属表面，以及诸如钢材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的组合。本专利技术的有益效果：通过制备特异性的结合人骨髓间充质干细胞的适配体以及相应的试剂盒可以用于实现特异性分离纯化人骨髓间充质干细胞，所述方法制备简单，成本低廉，可以用于批量制备所述的试剂盒。具体实施方式实施例1:人骨髓间充质干细胞成熟细胞的制备按照CN103421740A中公开的人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，获得成熟、活性高的人骨髓间充质干细胞，所述细胞为阳性表达:CD73，CD90，而阴性表达:CD34、CD45。按照CN104215773A一种鉴定骨髓间充质干细胞活性的方法对所述细胞进行鉴定，选择活性高的细胞作为后续使用。实施例2核酸适配体筛选从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TGGACAGACGTAAGACGTAA(N36)TGAGATGCCAGTAGTGACGA-3’。富集所用引物:F：5’-FAM-TGGACAGACGTAAGACGTAA-3’R：5’-biotin-TCGTCACTACTGGCATCTCA-3’将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥；用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgCl2,2mg/mLBSA,0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库,取250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速离心。反筛:将250pmol的文库吸入含有人脂肪来源间充质干细胞和人肌肉来源的间充质干细胞的直径6cm培养皿中，细胞浓度为2.0×106个/ml。用结合缓冲液补足到1mL；4℃摇床振荡3h；取上清液。正筛:将反筛上清液加入到含有实施例1制备的人骨髓间充质干细胞培养皿中，细胞浓度为2.0×106个/ml，4℃摇床振荡1h；弃上清液；用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgC12)洗涤人骨髓间充质干细胞细胞三遍；用1mL洗涤缓冲液将人骨髓间充质干细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒，其含有能特异性检测人成熟骨髓间充质干细胞的核酸适体。

【技术特征摘要】
1.一种用于人成熟骨髓间充质干细胞检测的试剂盒，其含有能特异性检测人成熟骨髓间充质干细胞的核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述适体的一端偶联有磁珠，用于富集分离得到的人成熟骨髓间充质干细胞。3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏乃东，
申请(专利权)人：魏乃东，
类型：发明
国别省市：天津;12