一种用于造血干细胞分离的适配子及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于造血干细胞分离的适配子及其试剂盒，所述适体具有较强的结合特性和稳定性；该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以造血干细胞为靶目标，从随机文库中筛选出了能与造血干细胞特异性结合的DNA适配子。本发明专利技术还涉及一种用于分离造血干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含能够从血液中快速分离造血干细胞，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于造血干细胞分离的适配子及其试剂盒。
技术介绍
造血干细胞是指具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其它细胞。近十多年来，随着对造血干细胞的功能认识和研究的不断深入，造血干细胞移植已成为治疗血液病、恶性肿瘤的有效方法，亦应用于治疗某些自身免疫性疾病。造血干细胞主要来源于外周血造血干细胞，脐带血干细胞等地方。然而，正常人外周血中造血干细胞的含量很低，CD34+细胞仅占外周血单个核细胞0.01％～0.1％，现有方法还无法对外周血中痕量造血干细胞直接分离和采集。因此，实现人体外周血中造血干细胞的高效富集，从而为探讨造血干细胞在疾病治疗方面的作用奠定基础。同时，脐血分离技术是建立脐血库和进行脐血移植研究的关键环节，它直接关系到脐血样本冻存的终体积、造血干/祖细胞分离率、细胞冻存复苏后的干细胞回收率、细胞的有效活性维持以及下一步研究的成败。脐血分离的目的主要是去除脐血中的红细胞、血小板和部分血浆，收集富含脐血干/祖细胞的有核细胞(NC)，通过分离使脐血浓缩和纯化，提高脐血干/祖细胞的浓度，以满足研究和保存的需要。目前脐血分离技术包括羟乙基淀粉(HES)沉淀法、Percoll溶液密度梯度离心法、单克隆抗体加流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法或氯化铵溶解法等。Denning-Kendall等对淋巴细胞液(Ficoll)分离、密度梯度离心分离、NH4C1溶解法、甲基纤维素法、明胶分离法、羟乙基淀粉(HES)沉降法等不同脐血分离方法的分离效果进行详细的分析和比较后认为，3％明胶沉降法的分离效果最好，其CD34+细胞的回收率和集落(CFU-C)回收率最高，分别达到86％和92％。溶解法次之，但其终体积较大因而实际应用价值不大。Ficoll和Percoll密度梯度离心法,虽然应用较广泛,但其对技术的要求较高而且费用相对较贵。而且Ficoll法单次分尚脐血量较小,在分尚血量多的样本时,使用的尚心管数多，工作量大，很容易造成污染，因此不适宜大批量脐血的分离。免疫磁分离技术是外周血细胞快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩人外周血样品中靶细胞，提高靶细胞检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法(ms)将抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标细胞进行捕获、富集，磁分离。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1)微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2)由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细胞之间通过多相反应(multiphasereaction)结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细胞；3)微米磁珠单分散性较差，在外周血基质中容易发生自身聚集或形成沉淀；4)传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5)血液粘稠度高并且其中非造血干细胞的血细胞浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对血液中造血干细胞特异性分离；6)微米磁珠的浓度过高会造成造血干细胞的破损(磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂)，导致分离的失败；7)磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。然而无论是免疫磁分离技术还是羟乙基淀粉(HES)沉淀法、Percoll溶液密度梯度离心法、单克隆抗体加流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法或氯化铵溶解法等方法，均具有分离方式复杂，成本高，时间久的缺点。SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合造血干细胞的适配体具有较为重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的技术方案通过以下步骤实现：本专利技术的目的是提供一种造血干细胞的核酸适配体序列。本专利技术中，所述的造血干细胞的核酸适配体(序列1-25)能够特异结合造血干细胞。本专利技术中，所述的造血干细胞选自人外周血造血干细胞。本专利技术的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本专利技术中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性分离人造血干细胞的试剂盒。从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-TCCCTCAAAGCGCACTATTA(N35)ATCATGGACGTGCTAATGAT-3’。中筛选出与造血干细胞特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物F(5，-FAM-tccctcaaagcgcactatta-3，)和R(5，-biotin-atcattagcacgtccatgat-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。本专利技术采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以人外周血造血干细胞为正筛靶标，以人红细胞为反筛靶标，筛选与造血干细胞特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合造血干细胞的序列，本专利技术中命名为适配体ZXST1-ZXST25。序列如下：ZXST1：TCCCTCAAAGCGCACTATTATCCCTACCTTATAATCACCTTCCCTCACATTACAAATCATGGACGTGCTAATGATZXST2：TCCCTCAAAGCGCACTATTACCTCTTCCTTTTTTCACATATTCCAAACAAAAACCATCATGGACGTGCTAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合造血干细胞的适体，其特征在于为包括SEQ ID No.1‑25任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合造血干细胞的适体，其特征在于为包括SEQIDNo.1-25任一条序列
所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。
2.权利要求1所示的适体在筛选造血干细胞的应用。
3....

【专利技术属性】
技术研发人员：汪晓明，
申请(专利权)人：汪晓明，
类型：发明
国别省市：浙江;33