从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用技术

本发明专利技术公开了一种从细胞或组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法其专用分离试剂、试剂盒与应用。该方法采用聚乙二醇(PEG)溶液，使细胞或组织培养上清或体液中的细胞外微囊疏离水溶液，再采用低速离心的方法浓缩并收集沉降的细胞外微囊。用本发明专利技术的方法每次可处理1000mL或以上的标本，与超速离心和层析法比较，该方法操作简单，所用时间短，无需大型仪器设备，且重复性好。本发明专利技术不但解决了细胞外微囊分离的难题，也将推动细胞外微囊的科研研究及其临床应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及细胞外微囊的获取技术，特别涉及一种从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与分离得到的细胞外微囊的应用。
技术介绍
在生理及病理条件下，静止及活化的细胞可以向细胞外空间及体液中释放一种囊泡性结构，它由脂类双层结构包裹，直径在几十纳米至几个微米之间，称为细胞外微囊，英文名称为extracellularvesicles(EV)。根据来源及囊泡大小不同，细胞外微囊也有其它名称，如肿瘤泌体(oncosomes)、前列腺泌体(prostasomes)、凋亡小体(apoptoticbodies)等。目前，人们倾向于根据细胞释放囊泡结构的方式，将细胞外微囊分为凋亡小体、脱落微囊(sheddingmicrovesicles)和外泌体(exosomes)三类囊泡结构。凋亡小体源于细胞凋亡过程中的凋亡球体。脱落囊泡由细胞膜发芽形成。外泌体通常较小，它在细胞内形成，是内吐囊泡以出芽的方式向内凹陷，形成多个囊泡组成的多囊泡内涵体，之后与质膜融合并将内容物释放到细胞外。近年来，细胞外微囊的作用越来越受到人们重视。细胞外微囊可发挥多种生理功能，通过其内的活性物质水平转移，如蛋白质、脂类物质、DNA和RNA等的转移，影响进入细胞的多种功能。细胞外微囊参与了多种生理及病理过程，如炎症反应、免疫调节、血管新生、血栓形成、神经系统疾病、癌症的发生、肿瘤细胞浸润及转移等。因此，细胞外囊泡是生理及病理状态下细胞间信息传递的关键物质基础之一。在某些疾病状态下，体液中细胞外微囊含量会提高，如心血管疾病、多种癌症包括神经母细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤和肾癌等，自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎，糖尿病和慢性肾功能不全等。由于细胞外微囊含有特定组织的标记，因此，它可作为这些疾病早期诊断及后续观察的生物标记物。细胞外囊泡也可能用于某些疾病的治疗。如美国FDA就批准了法国的研究者利用树突状细胞来源的细胞外微囊治疗黑色素瘤。此外，美国FDA批准的细胞外微囊临床试验项目还有：利用患者腹水微囊治疗结肠癌，利用单核细胞来源的微囊治疗非小细胞肺癌，利用间充质干细胞来源的微囊治疗糖尿病等。因此，细胞外微囊不但可以用于疾病的诊断，也可用于用于疾病的治疗，是一种新型的疾病的生物诊疗方式。然而，目前人们采用的细胞外微囊的分离方法过于繁琐，微囊的收获量也不稳定，微囊的分离、纯化方法亟待改进。目前，细胞外微囊的分离方法主要有：(1)超速离心法；(2)蔗糖密度梯度分离结合超速离心法；(3)层析法。超速离心或密度梯度超速离心，均需要价格昂贵的超高速离心机，离心机机箱内需达到真空状态，每次离心量一般只有60mL，离心时间至少需要6个小时。层析法利用微囊物理性状，通过高效层析柱收获目标物质，但每次加样量只有100-200mL，需要时间24小时以上。此外，由于细胞外微囊来源不同、来源的个体不同、或者来源细胞的状态不同，样品中细胞外微囊的含量差异很大，从而造成层析法获取细胞外微囊的浓度差异，影响后续的使用。因此，迫切需要一种新的细胞外微囊的分离方法及其专用分离试剂。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂。本专利技术所提供的细胞外微囊分离试剂是一种以具有体积排斥功能的聚合物(ploymer)为主要成分配制的溶液。所述具有体积排斥功能的聚合物本专利技术确定为聚乙二醇(PEG)，其英文名称为polyethyleneglycol，也可为PolyethyleneGlycol或polyethyleneglycol，简称PEG，其分子式为HO(CH2CH2O)nH，其分子结构如式Ⅰ所示，n为聚合度，与分子量相关，通常PEG为分子量大于600的半固体及固体物质，是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而成：应用于本专利技术中的聚乙二醇的分子量应大于或等于2000，最适宜分子量为4000-8000。以聚乙二醇为主要成分配制的溶液是将聚乙二醇用盐类溶液溶解后形成的溶液；所述盐类溶液为NaCl·Tris·HCl溶液或NaCl溶液。在以聚乙二醇为主要成分配制的溶液中，所述聚乙二醇的质量百分浓度为20％-60％(质量/体积，单位g/100mL)，优选的浓度为30％-48％，最优选为40％。所述聚乙二醇溶液在从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊中的用途也属于本专利技术。本专利技术的第二个目的是提供一种简易且重复性良好的从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法。本专利技术所提供的分离细胞外微囊的方法，是从含有细胞外微囊生物样品，如细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊，即去除生物样品中绝大部分的水、盐、蛋白质、核酸等成分，并将细胞外微囊进行浓缩。分离过程包括将样品与分离试剂混合后静置，再通过离心的方法将样品中的细胞外微囊沉降，去除上层液体并收集沉降物；这里离心是在低温、室温或者其它温度条件下，通过离心机使样品中的细胞外微囊沉降。本专利技术的分离细胞外微囊的方法，是将细胞外微囊分离试剂与细胞培养上清、组织培养上清或体液混合后静置，再离心，收集沉降物，得到细胞外微囊。所述体液包括血浆、血清、腹水、淋巴液等。所述细胞培养上清、组织培养上清或体液与细胞外微囊分离试剂的混合比例为1-5：1(体积比)，混合后聚乙二醇的终浓度为3％-20％(质量/体积，W/V)；优选的混合比例为3:1或4:1，混合后聚乙二醇的终浓度为6％-12％。所述静置条件为0-25℃静置1-24小时，优选为4℃静置12-18小时。所述离心温度为低温(0-8℃)、室温(20-25℃)或者其它温度(10-30℃)，优选为室温(20-25℃)；所述离心速度包括低速(600-5000rpm)、高速(5000-15000rpm)或超高速(100000-500000rpm)，优选为低速离心。离心条件优选为室温、低速(600-5000rpm)离心10-60分钟，最优选为室温、1200rpm离心30分钟。离心后沉降物的收集可以使用溶剂(如磷酸盐缓冲液、Tris-CL缓冲液或水等)溶解或直接储存，取出沉降物，沉降物即为目标产物—细胞外微囊。本专利技术的第三个目的是提供一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒，包括上述细胞外微囊分离试剂。本专利技术提供了一种从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法。该方法适于从细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂，是以聚乙二醇(PEG)为主要成分的聚乙二醇溶液，溶液中聚乙二醇的质量/体积浓度为20％‑60％(g/100mL)。

【技术特征摘要】
1.一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂，
是以聚乙二醇(PEG)为主要成分的聚乙二醇溶液，溶液中聚乙二醇的质量/体积浓度
为20％-60％(g/100mL)。
2.根据权利要求1所述的用于分离细胞外微囊的试剂，其特征在于：所述聚乙
二醇的分子量大于等于2000；优选分子量为4000-8000。
3.根据权利要求1或2所述的用于分离细胞外微囊的试剂，其特征在于：聚乙
二醇溶液的溶剂为盐类溶液；所述盐类溶液为NaCl·Tris·HCl溶液或NaCl溶液。
4.根据权利要求1或2或3所述的用于分离细胞外微囊的试剂，其特征在于：
所述溶液中聚乙二醇浓度优选为30％-48％；最优选为40％。
5.权利要求1至4任一所述聚乙二醇溶液在从细胞培养上清、组织培养上清或
体液中分离细胞外微囊中的用途。
6.一种从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法，是将
权利要求1至4任一的分离试剂与细胞培养上清、组织培养上清或体液混合后静置，
再离心，收集沉降物得到细胞外微囊。
7.根据权利要求6...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭子宽，
申请(专利权)人：细胞邦北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11