用于分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于诊断胎儿疾病的应用技术

本发明专利技术公开了一种产前分析胎儿的方法。所述方法包括：(a)分离胎盘来源微粒；和(b)分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
在一些实施方式中，本专利技术涉及从母体血液样品中分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于描绘胎儿特征的应用。
技术介绍
在怀孕期间通常要进行产前筛查以检测潜在的先天缺陷(如唐氏综合征、染色体异常、遗传病和其它状况)。优选地在怀孕的早期进行筛查。由多余的或缺失的染色体(非整倍体)引起的综合征是人类最广泛被识别的遗传病并且目前可以使用如羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样(CVS)的方法进行检查。但是，尽管能预测染色体畸变，所述羊膜穿刺术或 CVS方法分别带来了 0. 5-1%或2-4%的方法相关的流产风险。微囊泡(MV)包括微粒和外来体，其在正常生理状况的血液循环中出现并在多种疾病中增加。微粒(MP)是从多种细胞表面脱落的膜囊并包含少量的细胞质物质。细胞微粒由细胞骨架结构重排形成，其尺寸多样化(大约0. 1至Ιμπι)并且在磷脂和蛋白组合物中有差异。MP 包含 DNA 和 RNA(Reich CF 等 Exp Cell Res. (2009) 10 ；315 760-8)并且暴露特异于它们源于的细胞的膜抗原(Diamant等，Eur J Clin Invest (2004) 34 :392_401)。 例如，在循环中，有脱落自血小板、内皮细胞或白细胞的MP。在癌症患者中，可以检测到肿瘤细胞来源MP，在孕妇中可以发现胎盘来源MP。在暴露于细胞因子或毒素之后及在多种病理学(如炎症、癌症、糖尿病和其它血管疾病)中，有两种导致微粒形成的机制——细胞凋亡或激活。在血液中，MP看来似乎是具有膜结构的RNA的主要来源，所述膜结构保护核酸不被血液核酸酶消化。此外，循环的微粒通过在细胞间转移蛋白和RNA(如微小RNA)调节靶细胞及促进细胞与细胞的交互作用， 因此提高靶细胞膜上的蛋白表达并诱导细胞信号转导。循环的核酸可以提供诊断和预后意义的标记物。血液中的MP可以包含来自它们起源细胞(如肿瘤)的mRNA，所述mRNA的形式是可以被基因组技术分析的形式。在妊娠中，细胞外mRNA提供了用于评估胎儿基因表达的材料来源(Ng EK等，Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 15 ； 100)。滋养层细胞起始是作为早期胎儿胚细胞的外部覆盖层，其提供了母体子宫内膜和发育胚胎之间的营养途径。覆盖胎盘绒毛(vili)的人类绒毛膜滋养层细胞(HVT)提供了用于与母体循环交换氧气和营养物质的表面并且它们是暴露于母体循环的具有胚胎表型的唯一细胞。胎盘滋养层细胞分化通过细胞凋亡完成并且导致了合体滋养层细胞MP释放至母体循环中。所述合体滋养层细胞来源MP与体外循环的胎儿核酸相关 合体滋养层细胞来源MP可以在起始于怀孕中期的母体循环中被检测(即，使用ELISA和抗ND0G2抗体)，它们的数量在怀孕末期时增加且它们参与正常或先兆子痫怀孕中的系统炎症反应。用抗NDOGl抗体标记胎盘来源MP并用流式细胞术评估。之前的研究描述了通过从母体血液中分离胎儿有核细胞(如红细胞)并将它们用于遗传分析来进行胎儿分析(见如美国专利号5，750，339)。美国专利申请号20080261822描述了通过滋养层细胞的原位染色用于产前诊断的方法。根据它们的技术，从怀孕个体收集经子宫的标本并将所述标本进行滋养层细胞特异的免疫染色，随后进行基于原位DNA的遗传分析以测定胎儿性别和/或鉴定胎儿中染色体和/或DNA的异常。其它的文献包括 Orozco AF 等，American Journal of Pathology(2008) 173 1595-1608。
技术实现思路
根据本专利技术的一些实施方式的一个方面，提供一种产前分析胎儿的方法，所述方法包括(a)分离胎盘来源微粒；和(b)分析胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。根据本专利技术的一些实施方式的一个方面，提供一种从怀孕个体获得的血液样品中分离胎盘来源微粒的方法，所述方法包括(a)在使得至少一种试剂与胎盘来源微粒结合的条件下，用至少一种试剂接触所述血液样品，其中所述至少一种试剂与胎盘来源微粒特异结合而不与母体微粒结合；和(b)分离所述胎盘来源微粒，从而从血液样品中分离胎盘来源微粒。根据本专利技术的一些实施方式的一个方面，提供一种包含至少80 ％胎盘来源微粒的分离微粒群，所述胎盘来源微粒根据权利要求3的方法获得。根据本专利技术的一些实施方式的一个方面，提供一种用于产前分析胎儿的试剂盒， 所述试剂盒包括一种包裹材料和使用说明书，其中所述包裹材料包裹能够特异结合胎盘来源微粒的第一种试剂和用于分析所述胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分的第二种试剂。根据本专利技术的一些实施方式，所述方法进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前，从所述胎盘来源微粒中分离所述成分。根据本专利技术的一些实施方式，所述分离不通过FACS实现。根据本专利技术的一些实施方式，所述分离通过免疫沉淀实现。根据本专利技术的一些实施方式，所述方法进一步包括在所述接触之前离心所述血液样品以获得贫血小板血浆(PPP)。根据本专利技术的一些实施方式，所述试剂包括抗体。根据本专利技术的一些实施方式，所述抗体结合胎盘来源微粒的膜多肽。根据本专利技术的一些实施方式，所述抗体包括抗ND0G1抗体。根据本专利技术的一些实施方式，所述试剂结合多肽，所述多肽选自人绒毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盘催乳激素(hPL)、ND0G1、ND0G2、ND0G5、Trop-I 和 Trop-2。根据本专利技术的一些实施方式，所述分离根据权利要求3的方法实现。根据本专利技术的一些实施方式，所述至少一种成分包括核酸。根据本专利技术的一些实施方式，所述至少一种成分包括多肽。根据本专利技术的一些实施方式，所述特征是胎儿疾病。根据本专利技术的一些实施方式，所述胎儿疾病包括胎儿染色体畸变。根据本专利技术的一些实施方式，所述染色体畸变包括非整倍体。根据本专利技术的一些实施方式，所述胎儿疾病包括胎儿遗传突变。根据本专利技术的一些实施方式，所述遗传突变包括5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR)基因的多态性。 根据本专利技术的一些实施方式，所述特征是胎儿性别。根据本专利技术的一些实施方式，所述胎盘来源微粒是在从怀孕个体获得的血液样品中。根据本专利技术的一些实施方式，所述第一种试剂包括抗体。根据本专利技术的一些实施方式，所述抗体包括抗NDOGl抗体。根据本专利技术的一些实施方式，所述至少一种成分选自核酸和多肽。根据本专利技术的一些实施方式，所述试剂盒进一步包括至少一种用于从胎盘来源微粒中分离核酸的试剂。根据本专利技术的一些实施方式，所述试剂盒进一步包括至少一种用于从胎盘来源微粒中分离多肽的试剂。根据本专利技术的一些实施方式，所述第二种试剂选自寡核苷酸、探针、抗体和染料。根据本专利技术的一些实施方式，所述血液样品选自全血、分馏的全血、稀释的血液样品、未稀释的血液样品、血浆、血清和微粒。除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。示例性的方法和/或材料在下文中描述，但是与本文描述的那些相似或相当的方法和材料可以用在本专利技术实施方式的实践和测试中。如果有冲突，将以本专利技术的说明书，包括定义为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意味着必要的限定。附图说明仅出于举例的目的，参考附图在本文中描述本专利技术的一些实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿纳·阿哈龙，本亚明·布伦纳，
申请(专利权)人：健康公司拉姆巴姆，拉帕波特家族医学研究院，
类型：发明
国别省市：