一种适用于干细胞的线粒体分离方法技术

本发明专利技术提供一种用于高效分离干细胞活性线粒体的方法，包括如下步骤：1）将间充质干细胞检测表面标记鉴定，向骨、软骨和脂肪分化能力鉴定；2）胰酶消化，离心收集细胞；重悬清洗离心；3）配制线粒体提取液：A液是裂解液，C是终止反应液。4）A液重悬清洗过后的细胞沉淀进行涡旋、静置，重复数次；加入C液中止裂解，离心得白色沉淀留待第5步操作；上清液再离心得白色沉淀；5）第4步中首次离心的沉淀，重复第4步的操作；6）将第4步和第5步的白色沉淀放在一起，离心得白色沉淀，立即使用或者‑80度保存。本发明专利技术方法分离获得的线粒体活性好、纯度高，适用于间充质干细胞分离获得线粒体，且操作简便、不需要研磨。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于干细胞的生物技术，是一种简便的用于分离间充质干细胞的线粒体的方法。
技术介绍
线粒体是细胞中重要的一种细胞器，是真核细胞特有的，存在于绝大多数活细胞中，负责能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质―脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。研究线粒体内外膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构、功能及理化性质已经成为细胞生物学研究中的重要课题。近年来的研究显示，无论是正常细胞的衰老进程，还是肿瘤细胞的癌变，或者干细胞的增殖、分化，都与线粒体密切相关。人们通常认为，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌、肝、肾等细胞，大量制备线粒体就是从这些器官组织及细胞中提取。随着干细胞生物学及线粒体研究的迅速发展，人们发现线粒体（mitochondria）在干细胞的增殖、分化、老化过程中发挥着重要的作用。近几年，人们分离具有活性的干细胞线粒体，用于线粒体的体内移植（cell-free transplantation），治疗遗传性疾病或者损伤性疾病。这些对线粒体结构与功能的研究通常是要在离体的线粒体上进行的。随着线粒体研究的深入发展，分离线粒体的方法不断改进。然而，人们主要研究心、肝、脑等主要耗能的器官组织的线粒体，因此分离这些组织和细胞的线粒体的方法较为成熟, 对于干细胞线粒体的研究较少, 其提取方法不很成熟。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：在以前研究的基础上提供一种更为简便、有效的适用于干细胞的线粒体分离方法。本专利技术通过体外培养、扩增间充质干细胞，分离获得间充质干细胞来源的线粒体。经过詹纳斯绿B（Janus green B）染法或者MitoTracker Red荧光染色方法，证实本方法获得的绝大部分线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有较好的ATP活性，可以用于干细胞线粒体生理功能的测定，也可以用于细胞移植治疗。本专利技术提供的干细胞线粒体分离方案，分离获得的线粒体纯度高，活性好；方法简便、不需要研磨，为一个简单、有效的实用方法。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：一种适用于干细胞的线粒体分离方法，该方法包括如下步骤：1)将传代扩增（P1-P3代）的间充质干细胞，流式细胞仪检测表面标记鉴定，向骨、软骨和脂肪分化能力鉴定；2)0.25%胰酶消化，离心850g，5min收集细胞；用PBS重悬清洗离心数次；3)采用细胞线粒体提取试剂盒(Mitochondria Isolation Kit, #89874，ThermoFisher Scientific），根据试剂盒的操作手册，计数细胞数量，以确定要配制的线粒体提取液的用量；碎冰上配制线粒体提取液：A液是裂解液，C是终止反应液，临用前在A液中加入PMSF（1mmol/L ，上海碧云天生物技术有限公司）；4)取A液重悬PBS清洗过后的细胞沉淀，转移到EP管中（方便涡旋），涡旋，碎冰上静置2 min，重数次；然后，加入C液中止裂解，用移液枪头轻柔的混合均匀（勿涡旋），立即离心，管里的沉淀留待第5步操作，上清液转移至新的EP管中，离心；离心后可以见到白色的沉淀（即线粒体），弃上清，用C液重悬沉淀；5)第4步中第一次离心下来的EP管中的沉淀，再用A液重悬，转移至新的EP管中，重复第4步的操作；6)将第4步和第5步的结果混合放在一起，离心，离心后弃上清，C液重悬管底的沉淀（即线粒体），马上使用或者-80度保存。在采用上述技术方案的同时，本专利技术还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：所述分离方法的目的是分离离体培养的间充质干细胞来源的线粒体。用于分离的原代培养的间充质干细胞，是在传代P1-P3之间。用于分离的原代培养的间充质干细胞，自P0代开始一直用10% FBS低糖DMEM(葡萄糖含量为1100毫克/升)培养基，在37℃, 5%CO2及一定湿度条件下对细胞进行常规培养，在线粒体分离前48小时，更换为10% FBS高糖DMEM（葡萄糖含量为4500毫克/升），以促进线粒体的生成。本方案适用于其他各种干细胞的线粒体分离，包括胚胎来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞等其他各种来源的间充质干细胞。本方案分离得到的线粒体，可以用于线粒体移植，作为无细胞治疗策略，可用于神经、心脏、肝脏、肾脏等组织器官损伤的修复再生。本方案分离得到的线粒体，可以用于线粒体生理病理功能的应用检测。本方案分离得到的线粒体，也可以被线粒体裂解液或其它适当裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western Blot、双向电泳等蛋白分析。本专利技术的有益效果是：1)适用于间充质干细胞分离获得线粒体；2)分离获得的线粒体纯度高（>97%）；3)分离获得的线粒体活性好；4)方法简便、不需要研磨。附图说明图1是采用高糖和低糖培养基处理48h后BMSCs线粒体生成的对比图。图2是损伤运动神经元的耗氧率指标对照图。增加了本专利技术分离所得线粒体以后，损伤的运动神经元的耗氧率明显升高。图3是损伤运动神经元的细胞外酸化率指标对照图。细胞外酸化率反应细胞外产酸能力间接显示糖酵解能力，从图中可以显然看出，增加了本专利技术分离所得的线粒体以后，细胞外酸化率明显下降。图4是氧糖剥夺损伤的运动神经元的氧耗率与酸化率比值。如图所示，损伤神经元的数据偏在左下角，说明是无氧糖酵解的能量代谢特征，但是增加了本专利技术分离所得的线粒体以后，数据向右上角移动，表明氧化磷酸化程度增加。具体实施方式实施例1：来源于骨髓间充质干细胞的线粒体的分离。采用本实施例的方法分离来源于骨髓间充质干细胞，具体包括以下步骤：1)将传代扩增（P1-P3代）的骨髓间充质干细胞（BMSCs），流式细胞仪检测表面标记鉴定，向骨、软骨和脂肪分化能力鉴定。2)2×107个（BMSCs），0.25%胰酶消化，离心850g，5min收集细胞；用PBS重悬清洗离心2次。3)采用细胞线粒体提取试剂盒(Mitochondria Isolation Kit, #89874，ThermoFisher Scientific），根据操作手册，计数细胞数量，以确定要配制的线粒体提取液的用量。冰上配制线粒体提取液：A液是裂解液，C是终止反应液。临用前在A液中以1:100的比例加入PMSF（2ml A液 +20 μl PMSF）。4)取A液2 ml重悬PBS清洗过后的细胞沉淀，转移到7 ml EP管中（方便涡旋），涡旋30 S，冰浴精确放置2 min（不要超过），重复3数次；然后，加入2 ml C液中止裂解，用移液枪头轻柔的混合均匀（勿涡旋）。分装到4个1.5 ml的EP管中，每管1 ml，立即离心（2000g，10min），每管的沉淀留待第5步操作，上清液转移至新的1.5 ml EP管中，离心（12000 g，10 min）；离心后可以见到白色的沉淀（即线粒体），弃上清，用C液重悬沉淀（200 μl/管）。5)第4步中第一次离心下来的4个1.5 ml EP管中的沉淀，再用A液总共2 ml重悬，转移至7 ml EP管中，重复第4步的操作。6)将第4步和第5步两次的结果放在一起，离心（12000g，10min），离心后弃上清，200 μl C液重悬，马上使用或者-80度保存。实施例2：离体培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于干细胞的线粒体分离方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）将传代扩增P1~P3代的间充质干细胞，采用流式细胞仪检测表面标记鉴定，进行向骨、软骨和脂肪分化能力鉴定；2）间充质干细胞经过胰酶消化，离心收集细胞；用PBS重悬清洗离心数次；3）采用细胞线粒体提取试剂盒，根据试剂盒的操作手册，计数细胞数量，以确定要配制的线粒体提取液的用量，将线粒体提取液放在碎冰上进行配制；4）取A液重悬PBS清洗过后的细胞沉淀，转移到EP管中，涡旋，碎冰上静置，重复数次；然后，加入C液中止裂解，用移液枪头轻柔的混合均匀，立即离心，管里的沉淀留待第5步操作，先将上清液转移至新的EP管中，离心；离心后可以见到白色的沉淀，弃上清，用C液重悬沉淀；5）第4步中第一次离心下来的EP管中的沉淀，再用A液总共重悬，转移至新的EP管中，重复第4步的操作；6）将第4步和第5步的结果混合在一起，离心，离心后弃上清， C液重悬管底的沉淀，马上使用或者‑80度保存。

【技术特征摘要】
1.一种适用于干细胞的线粒体分离方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）将传代扩增P1~P3代的间充质干细胞，采用流式细胞仪检测表面标记鉴定，进行向骨、软骨和脂肪分化能力鉴定；2）间充质干细胞经过胰酶消化，离心收集细胞；用PBS重悬清洗离心数次；3）采用细胞线粒体提取试剂盒，根据试剂盒的操作手册，计数细胞数量，以确定要配制的线粒体提取液的用量，将线粒体提取液放在碎冰上进行配制；4）取A液重悬PBS清洗过后的细胞沉淀，转移到EP管中，涡旋，碎冰上静置，重复数次；然后，加入C液中止裂解，用移液枪头轻柔的混合均匀，立即离心，管里的沉淀留待第5步操作，先将上清液转移至新的EP管中，离心；离心后可以见到白色的沉淀，弃上清，用C液重悬沉淀；5）第4步中第一次离心下来的EP管中的沉淀，再用A液总共重悬，转移至新的EP管中，重复第4步的操作；6）将第4步和第5步的结果混合在一起，离心，离心后弃上清， C液重悬管底的沉淀，马上使用或者-80度保存。2.根据权利要求1所述的一种适用于干细胞的线粒体分离方法，其特征在于，所述分离方法的目的是分离离体培养的间充质干细胞来源的线粒体。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琳琳，张晓明，王超，陈莹莹，沈岳良，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33