一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法技术

本发明专利技术涉及一种绵羊精原干细胞的分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法，包括制备各种溶液，然后从3-4月龄的绵羊睾丸中取2-3g曲细精管组织块，经过两步酶解消化制备单细胞悬液，进而用差别贴壁法分离纯化精原干细胞，使用SSCM培养液实现绵羊精原干细胞的传代长期培养，对传代长期培养的绵羊精原干细胞进行冻存和复苏的方法。本发明专利技术提供的技术方案实现了不需使用特定的绵羊精原干细胞抗体就能获得纯度较高的绵羊精原干细胞，建立了绵羊精原干细胞传代长期培养体系、成功地建立了液氮冷冻法长期保存绵羊精原干细胞的方法。使用本发明专利技术提供的方法分离纯化并且传代的绵羊精原干细胞至少已经培养达40代以上，如果加上冻存时间，最长的培养期已达4年。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家畜种质资源保存和优良品种繁育、组织器官再生等生物
，具体涉及。
技术介绍
精原干细胞(SSCs)是最重要的成体干细胞之一。精原干细胞不仅有传宗接代的遗传功能，近来研究显示，精原干细胞很容易通过退分化产生多能干细胞，这使得精原干细胞操作技术得到生命科学、农业科学和医学各路专家的垂青。自从精原干细胞移植技术建立以来，精原干细胞的研究开始加速，2000年后，建立了小鼠和大鼠精原干细胞的体外长期培养方法，精原干细胞基础研究和应用研究都得到了迅速的发展。一方面，培养的精原干细胞经过遗传修饰再移植到受体睾丸，通过精子发生过程产生转基因的精子，进而繁殖出转基因动物。另一方面，培养的精原干细胞通过退分化产生生殖多能干细胞，用于再生医学研究，将能够应用于损伤的组织器官的再生修复。因此精原干细胞在生殖生物学研究、转基因动物技术研究、退分化诱导产生多能干细胞研究、动物种质资源保存研究及组织器官康复临床医疗研究上具有重要意义。在遗传育种领域，父系的遗传性状是通过精原干细胞分化产生的精子通过受精传给后代的。以前绵羊繁殖及绵羊品种改良的体外研究(或称试管研究)集中在卵母细胞上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绵羊精原干细胞分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：配制溶液：1)将体积百分比为0.1％的抗菌‑抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液A，两周内使用；2)将IV型胶原酶以20mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成IV型胶原酶储备液，‑20℃保存；3)将透明质酸酶以10mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成透明质酸酶储备液，‑20℃保存；4)将DnaseI以5mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液，再加入体积百分比为20％的甘油，制成DNaseI储备液，‑20℃保存；5)将体积百分比为0.5％的Trypsin和浓度为2mM EDTA溶于PBS缓冲液中制成Try...

【技术特征摘要】
1.一种绵羊精原干细胞分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步:配制溶液: . 1)将体积百分比为0.1 %的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液A，两周内使用； .2)将IV型胶原酶以20mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成IV型胶原酶储备液，-20°C保存； . 3)将透明质酸酶以10mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成透明质酸酶储备液，_20°C保存； .4)将DnaseI以5mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液，再加入体积百分比为20%的甘油，制成DNaseI储备液，_20°C保存； . 5)将体积百分比为0.5 %的Trypsin和浓度为2mM EDTA溶于PBS缓冲液中制成Trypsin/EDTA 储备液，_20°C保存； . 6)将体积百分比为10%的胎牛血清和0.1%的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液C，两周内使用；. 7)将体积百分比为5.5%的马血清、2.4%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液B，两周内使用； 8)将30μ M的β-硫基乙醇加入培养液C中，过滤灭菌制成培养液D，现配现用； 9)将体积百分比为0.52%的牛血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，过滤灭菌制成PBS-BSA溶液，现配现用； 第二步:应用两步酶解法制备绵羊睾丸组织单细胞悬浮液，无菌条件下操作步骤依次如下: . 1)从3-4月龄的绵羊睾丸中取2-3g曲细精管组织块，放入载有2.5ml培养液A的.100mL培养皿中，用镊子除去曲细精管组织块上的睾丸白膜和较大的血管； .2)将所剩的组织块放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持续剪3分钟； .3)将剪碎的组织块转移到一个100mL带盖的大口瓶中，补加培养液A至7.5ml ； . 4)进行第一步酶消化，具体操作如下:在上述100mL带盖的大口瓶中加入0.63ml的IV型胶原酶储备液，置于37°C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡40min ;然后加入0.825ml的透明质酸酶储备液和0.125ml的DNaseI储备液，继续置于37°C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡20min。 . 5)从水浴摇床中取出100mL带盖的大口瓶，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次； . 6)将步骤5)所述100mL带盖的大口瓶中的悬浮液转入50ml离心管，以2000rpm的转速离心6min,除去上清液； . 7)在步骤6)所述离心管中加入12ml的PBS缓冲液，摇匀使沉淀物重新悬浮，以.2000rpm的转速离心6min,除去上清液； .8)重复步骤7的操作一次； . 9)进行第二步酶解，在步骤8)所述离心管中加入0.75ml的培养液A重新悬浮沉淀物，再.加入1ml的Trypsin/EDTA储备液和0.25ml的DNaseI储备液，置于37°C水浴摇床中，以.90rpm的转速摇荡lOmin，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；10)在步骤9)所述离心管中加入IOml的培养液C，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物直到明显的块状物消失； 11)将步骤10)所述离心管以2000rpm的转速离心6min,除去上清液,然后用2ml培养液C重悬细胞； 12)先用200目尼龙过滤器然后用300目尼龙过滤器分别过滤步骤11)所述细胞悬浮液； 13)将步骤12)所述的过滤后的细胞悬浮液用IOml移液管温和地吸吹5-10次，进行细胞计数，然后加入培养液C调整细胞密度至1.25xl06细胞/ml，制成单细胞悬浮液； 第三步:从第二步所述单细胞悬浮液中纯化精原干细胞，操作步骤依次如下: 1)将IOml第二步步骤13)所述的单细胞悬浮液铺于直径为IOOmm的明胶包被培养皿，放在32.50C ,5.5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养2天半至3天半； 2)用5ml移液管从步骤I)中所述培养皿中温和地移除所有培养液； 3)先用培养液A洗细胞 :从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的培养液A，温和地来回晃动培养皿I次，然后用移液管移除培养液； 4)再用PBS缓冲液洗细胞两次:从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的PBS缓冲液，温和地来回晃动培养皿I次，立即用移液管移除上清液，再重复操作一次； 5)加4ml培养液A至培养皿中，用移液管吸吹培养液A轻轻冲洗培养皿整个表面大约2遍； 6)将步骤5)所述培养皿中的冲洗液转移到无菌的50ml离心管中； 7)将步骤6)所述离心管于2000rpm离心6min,移去上清液,保留细胞沉淀； 8)在步骤7)所述离心管中加入4ml的培养液B重悬细胞； 9)在collagenI包被的培养皿中加入4ml培养液B，再铺上步骤8)所述细胞悬浮液，然后将培养皿放进32.5°C、5.5 % CO2、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2小时； 10)从培养箱中取出培养皿，用5ml移液管温和地在培养皿表面反复吸吹5-10次，使细胞混合，再将培养皿放回培养箱中继续培养2小时； 11)从培养箱中取出培养皿后，用5ml移液管在培养皿中温和地吸吹细胞悬浮液，直至冲洗过整个培养皿表面，再用5ml移液管从培养皿中收集collagen I不吸附的细胞悬浮液，全部转移到50ml离心管中； 12)将步骤11)所述离心管在2000rpm下离心6min,沉淀细胞,除去上清液,用4ml培养液D悬浮细胞，然后吸取细胞悬浮液通过200目尼龙过滤器，用50ml试管收集滤液； 13)迅速地将步骤12)得到的滤液用5ml移液管温和的吸吹4_5次，然后将混合好的滤液按每孔Iml铺入Laminin包被的12孔培养板，其中所述培养板预先准备好，临用时先移除每个孔中的上清液，再加入1ml培养液A清洗，移除所有培养液A后才铺入上述滤液； 14)将步骤13)所述培养板置于32.5°C,5.5 % CO2，饱和湿度的细胞培养箱中孵育20-40...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴应积，罗奋华，张岩，刘林洪，萨初拉，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15