一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法技术

本发明专利技术涉及一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其包括以下步骤：1)取经血样本，加入样本保存液混匀，然后进行离心，收集沉淀物；2)将步骤1)得到的沉淀物加入红细胞裂解液中，混匀后静置进行裂解，然后进行离心，收集沉淀物；3)将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬，然后进行细胞培养，收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞。本发明专利技术所述的分离提取方法能够快速、有效分离提取经血源性子宫内膜干细胞，而且操作简单，细胞收率高，细胞活性的损伤少。

【技术实现步骤摘要】
一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法
本专利技术涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取方法，特别是涉及一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法。
技术介绍
近年来，细胞疗法的兴起激发了对各种干细胞的研究热潮，而存在于骨髓、脐带、脐带血、脂肪、经血等多种成体组织中的成体干细胞(AdultStemCells，ASCs)，不仅克服了胚胎干细胞取材难、分化不确定及伦理问题等限制，同时能保持高效增殖能力和多向分化潜能，为细胞治疗提供了良好的种子细胞。子宫作为人体中具有超强再生能力的器官，其子宫内膜在每个月经周期中会增长约5～7mm，而以这种增长速率，子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生过程，这不仅表明经血源性子宫内膜干细胞(Menstrualblood-derivedEndometriumStemCells，MenESCs)的来源丰富，同时也暗示MenESCs具有较强的增殖活性。作为ASCs家族的重要成员，MenESCs除表达CD29(>99％)、CD44(>99％)、CD73(>99％)、CD90(>95％)及CD105(>99％)等ASCs表面标志物外，同时表达多向分化潜能标志物Oct-4、SSEA-4、Sox-2及Nanog，暗示MenESCs具有较高分化潜能。此外，相较于骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脐带血来源的ASCs等，MenESCs不仅具有更佳的增殖活性，同时亦具有较强的遗传稳定性(传至68代时核型无畸变)。同时，研究表明，MenESCs不表达MHCΙΙ类受体，微量表达MHCΙ类受体，暗示MenESCs具有较低的免疫原性。因此，MenESCs一经报道，凭借其来源丰富、无创伤的分离方式以及较高的增殖活性和分化潜能等方面的优势，获得了国内外的广泛关注。在临床应用MenESCs的安全性获得保障的前提下，其已在成骨、心肌、肝脏、子宫内膜及中风等疾病的治疗过程中展示了令人满意的效果。目前，从经血样本中分离提取MenESCs的方法主要是依赖Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心后收集白膜层中的有核细胞，进一步洗涤后进行后续培养。虽然利用该方法可成功分离提取MenESCs，但仍然存在以下不足：首先，分离MenESCs时所用的Ficoll淋巴细胞分离液主要有葡聚糖和泛影酸钠组成，其密度为1.077±0.0001g/mL，可分离比人淋巴细胞密度小的单个核细胞。在使用过程中，如果所需分离的标本量较少，使用细胞分离液能形成较好的单核细胞层，也方便收集；但如果需要分离的标本量较多，不但分离液使用量大，且离心后部分红细胞仍然悬浮在分离液中，致使收集细胞中混杂较多红细胞，而红细胞层内也混杂有核细胞，致使细胞收率较低。对于捐献者在一个月经周期中可收集到的经血样本超过50mL，等比例稀释到保存液中后超过100mL，完全通过密度梯度离心不仅会消耗掉大量淋巴细胞分离液，增加操作的经济和时间成本，同时由于样本量较多，势必会降低MenESCs的收率，而较长时间的离心对细胞活性的损伤较多。其次，经血样本相比外周血样本较为复杂，存在较多粘液物质及大量血凝块，在密度梯度离心后不仅可见明显的白膜层，同时可见大量悬浮的脱落子宫内膜碎片。实验发现，悬浮的脱落子宫内膜碎片中含有大量的MenESCs，而许多脱落的子宫内膜碎片由于与血液形成血凝块，因此通过密度梯度分离后会与血细胞沉淀在离心管最底层，从而降低了MenESCs的收率。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于，提供一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其能够快速、有效地分离提取经血源性子宫内膜干细胞，而且操作简单，细胞收率高，细胞活性的损伤少。一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，包括以下步骤：1)取经血样本，加入样本保存液混匀，然后进行离心，收集沉淀物；2)将步骤1)得到的沉淀物加入红细胞裂解液中，混匀后静置进行裂解，然后进行离心，收集沉淀物；3)将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬，然后进行细胞培养，收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞(MenESCs)。优选地，所述的样本保存液为含有50～150U/mL青霉素、0.8～1.2mg/mL链霉素、0.05～0.1mg/mL两性霉素B和0.2～0.5mg/mLEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)的PBS缓冲液。更优选地，所述的样本保存液为含有100U/mL青霉素、1mg/mL链霉素、0.1mg/mL两性霉素B和0.3mg/mLEDTA-Na2的PBS缓冲液。优选地，所述的红细胞裂解液为含有120～180mmol/LNH4Cl、5～15mmol/LKHCO3和0.05～0.15mmol/LEDTA-Na2的水溶液。更优选地，所述的红细胞裂解液为含有150mmol/LNH4Cl、10mmol/LKHCO3和0.1mmol/LEDTA-Na2的水溶液。优选地，所述的红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4，优选为7.2。优选地，所述的细胞培养基为含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。优选地，在步骤1)中，经血样本与样本保存液的用量体积比为1:1～1:3；离心的转速为1200～1500rpm，离心的时间为5～10分钟。优选地，在步骤2)中，红细胞裂解液与经血样本的用量体积比为1:2～1:3；裂解的时间为5～10分钟；离心的转速为1200～1500rpm，离心的时间为5～10分钟。优选地，在步骤3)中，所述细胞培养的接种密度为5～10×104cells/cm2；所述的细胞培养是在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养。优选地，在步骤3)中，所述的细胞培养是将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬后，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2天，用PBS缓冲液洗掉未贴壁的细胞，再加入细胞培养基继续培养，此后每隔3天更换一次细胞培养基，直至细胞融合至80％后进行传代。本专利技术所述的经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，通过采用所述的红细胞裂解液对经血样本进行裂解，可最大限度地保留子宫内膜，能够显著提高目标细胞的收率；同时，该分离提取过程的离心转速低(仅需1200～1500rpm)、时间短(仅需5～10分钟)，能够显著降低对细胞活性的损伤。本专利技术的分离提取方法无需淋巴细胞分离液，无需采用密度差异来分离提取有核细胞，避免了使用淋巴细胞分离液所必需的1800rpm下离心20分钟的高速离心过程，因而能够有效减少高速离心对细胞造成的机械损伤。本专利技术的分离提取方法操作简单，能够快速、有效地分离提取得到所述的经血源性子宫内膜干细胞，降低经济和时间成本。本专利技术的分离提取方法所采用的样本保存液，通过加入EDTA-Na2，能够有效发挥抗凝血的作用，并且通过青霉素、链霉素和两性霉素B的联合使用，能够有效发挥抗细菌、抗真菌作用，且不会影响MenESCs的细胞活性。EDTA-Na2可与经血样本中的钙离子结合成螯合物，使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固，避免经血样本凝固对MenESCs分离造成影响；青霉素、链霉素具有良好的杀菌、抑菌作用，而两性霉素B对样本收集部位(阴道)所存在真菌具有较强的杀菌、抑菌作用，三者联合使用具有更强、更广谱的抗菌作用。本专利技术的分离提取方法所采用的红细胞裂解液，通过NH4Cl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，包括以下步骤：1)取经血样本，加入样本保存液混匀，然后进行离心，收集沉淀物；2)将步骤1)得到的沉淀物加入红细胞裂解液中，混匀后静置进行裂解，然后进行离心，收集沉淀物；3)将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬，然后进行细胞培养，收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，包括以下步骤：1)取经血样本，加入样本保存液混匀，然后进行离心，收集沉淀物；2)将步骤1)得到的沉淀物加入红细胞裂解液中，混匀后静置进行裂解，然后进行离心，收集沉淀物；3)将步骤2)得到的沉淀物用细胞培养基重悬，然后进行细胞培养，收集培养获得的细胞，即为所述的经血源性子宫内膜干细胞。2.根据权利要求1所述的经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其特征在于：所述的样本保存液为含有50～150U/mL青霉素、0.8～1.2mg/mL链霉素、0.05～0.1mg/mL两性霉素B和0.2～0.5mg/mLEDTA-Na2的PBS缓冲液。3.根据权利要求1所述的经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其特征在于：所述的红细胞裂解液为含有120～180mmol/LNH4Cl、5～15mmol/LKHCO3和0.05～0.15mmol/LEDTA-Na2的水溶液。4.根据权利要求3所述的经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其特征在于：所述的红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4。5.根据权利要求1所述的经血源性子宫内膜干细胞的分离提取方法，其特征在于：所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林俊堂，刘彦礼，牛荣成，杨慈清，乔梁，管丽红，李小英，杨芬，孙钰椋，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41