一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用技术

本发明专利技术公开了一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用。本发明专利技术根据BHK21细胞在ZN‑MEM基础培养基中生长及代谢水平，提出了一种BHK21细胞专用的流加浓缩培养液，包括氨基酸、葡萄糖、维生素和其它添加物成份。同时，在BHK21细胞批式培养基础上，设计了一套个性化流加策略，经规模化培养应用，进一步优化生物反应器关键控制参数，确定了BHK21细胞的流加培养方法。该方法有效消除了底物和产物的抑制和毒害作用，促进了细胞的生长和代谢，提高了细胞的培养效能。采用本发明专利技术方法获得的BHK21细胞，对口蹄疫病毒的感染性增加，病毒的有效抗原含量得到显著提升，提高了口蹄疫病毒的生产效率，从而为高品质疫苗的生产奠定了基础，具有显著的经济效益。

High density flow culture method of BHK21 suspension cell and its application in proliferation of foot-and-mouth disease virus

The invention discloses a BHK21 suspension cell high-density current culture method and its application in the proliferation of foot and mouth disease virus. According to the invention of BHK21 cells in the growth and metabolism of ZN in the medium MEM culture, BHK21 presents a special cell culture fluid flow and concentration, including glucose, amino acids, vitamins and other additive ingredients. At the same time, BHK21 cells in batch culture based on the design of a personalized feeding strategy, the scale of training application, further optimize the bioreactor key control parameters were determined in BHK21 cells fed batch culture method. The method effectively eliminates the inhibition and toxicity of substrates and products, promotes cell growth and metabolism, and improves cell culture efficiency. Obtained by the method of the invention of the BHK21 cells infected with foot-and-mouth disease virus antigen content increased, the effective virus has been significantly improved, improve the production efficiency of the foot-and-mouth disease virus, which laid the foundation for high-quality vaccine production, has significant economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用
本专利技术涉及一种BHK21悬浮细胞的培养方法，特别涉及一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法、用于该方法的流加培养液以及该方法在口蹄疫病毒增殖中的应用。本专利技术属于细胞培养

技术介绍
口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，FMD)是致偶蹄动物感染的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称，国际兽疫局(OIE)将其列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且会引起人们对食品安全担忧等一系列社会问题。目前的防控手段主要是采取扑杀感染动物和免疫接种健康易感动物达到净化的目的。随着生物生产技术的不断发展，对疫苗产品品质提出了更高的要求。因此开发和优化BHK-21细胞的大规模培养技术，研究维持细胞生长和病毒繁殖的最优化环境控制，是口蹄疫疫苗生产的必然趋势。本专利技术根据BHK-21细胞基础代谢流水平，在前期研究得到的一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基(命名为ZN-MEM，申请号为201510980603.7)的基础上，设计了营养物均衡供给的流加培养基，并调整了ZN-MEM中葡萄糖以及谷氨酰胺的含量，采用调整后的ZN-MEM基础培养基和流加培养基进行流加培养，设计不同的流加策略，确定适宜于口蹄疫病毒生产的BHK-21细胞流加培养关键过程控制工艺参数，使得培养细胞在维持高活率的条件下，终密度提高近2倍左右，细胞代谢副产物浓度降低30％，增殖的口蹄疫病毒抗原含量提高达80％左右，提高了口蹄疫病毒的生产效率，为口蹄疫疫苗高效大规模工业化生产奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种成分较为明确、培养效果显著的适用于BHK-21细胞流加培养的个性化浓缩培养液；本专利技术的目的之二是提供一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法；本专利技术的目的之三是提供所述流加培养方法在口蹄疫病毒增殖中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种适用于BHK-21细胞流加培养的浓缩培养液，由以下含量的各原料物质组成：在本专利技术所述的浓缩培养液中，优选的，由以下含量的各原料物质组成：进一步的，本专利技术还提出了所述的浓缩培养液在BHK-21细胞培养中的应用。再进一步的，本专利技术还提出了一种BHK-21悬浮细胞高密度流加培养方法，该方法利用生物反应器进行流加培养，所用培养基为调整后的ZN-MEM基础培养基，在细胞培养过程中，补加本专利技术所述的浓缩培养液，继续培养，收获细胞；其中，所述的调整后的ZN-MEM基础培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：①氨基酸部分，包括：②平衡盐部分，包括：③维生素部分，包括：④其它添加物，包括：优选的，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：①氨基酸部分，包括：②平衡盐部分，包括：③维生素部分，包括：④其它添加物，包括：在本专利技术所述的方法中，优选的，以初始接种密度0.4～0.5×106个/ml向调整后的ZN-MEM基础培养基中接种复苏后的BHK-21细胞，培养参数：温度为36.5～37.0℃，pH值为6.8～7.0，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为100～120r/min；在细胞培养至24-36h，细胞生长密度达到1.5×106个/ml以上时，开始补加本专利技术所述的浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h-60h，再补加原培养基体积2％的本专利技术所述的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞；优选的，在细胞培养至24h，细胞生长密度达到1.5×106个/ml以上时，开始补加本专利技术所述的浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h，再补加原培养基体积2％的本专利技术所述的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞。在本专利技术所述的方法中，优选的，补加培养液后的培养参数为：温度37.0～37.5℃、pH值为6.95～7.20、DO值为50.0％～80.0％、搅拌转速为60～100r/min、渗透压值为260～320mOsm/L，更优选的，培养参数为：温度37.0、pH值为6.95、DO值为80.0％、搅拌转速为100r/min、渗透压值为320mOsm/L。再进一步的，本专利技术还提出了按照本专利技术所述的方法制备得到的BHK-21细胞及所述的BHK-21细胞在口蹄疫病毒增殖中的应用，相对于普通BHK-21细胞，该BHK-21细胞对口蹄疫病毒的感染性增加。其中，优选的，所述的病毒增殖包括向按照本专利技术所述的方法制备得到的BHK-21细胞接种病毒，设定控制参数为：温度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值为50.0％～70.0％，搅拌转速为50～70r/min，进行病毒增殖培养。更优选的，设定控制参数为：温度37.0℃，pH值7.6、DO为50.0％、搅拌为70r/min，进行病毒增殖培养。其中，优选的，所述的口蹄疫病毒为FMD/O/MYA98/BY/2010、FMD/Re-AWH/09和FMD/Asia1JSL/06毒株。相较于现有技术，本专利技术的有益效果为：1、采用本专利技术建立的流加培养方法培养的BHK-21细胞，细胞活率保持在96％以上，细胞密度可达6.0×106个/ml，较普通批式培养提高近2倍；2、采用本专利技术建立的流加培养方法培养BHK-21细胞，通过优化生物反应器设定参数，有效控制了细胞及环境因素的变化，确保了生产过程的一致性和稳定性，确保细胞产品产量和质量在可控范围内，BHK-21细胞在流加培养过程中，乳酸浓度低于9.4mM，氨离子浓度小于4.5mM，有效地消除了底物和产物抑制、毒害作用，促进了细胞的生长和代谢，提高了细胞的培养效能；3、采用本专利技术建立的流加培养方法获得的BHK21细胞，对口蹄疫病毒的感染性增加，病毒的有效抗原含量得到显著提升(提高80％左右)，从而实现了BHK21细胞高密度悬浮培养的目标，达到了细胞培养过程的可控性和有效性，提高了口蹄疫病毒的生产效率，为高品质疫苗的生产奠定了基础，具有显著的经济效益。附图说明图1为不同葡萄糖浓度对细胞增殖的影响；图2为不同氨浓度对BHK-21细胞生长的影响；图3为乳酸浓度对细胞增殖的影响；图4为BHK21细胞流加培养和批式培养的生长曲线；图5为应用流加培养基代谢产物的积累；图6为不同组别病毒滴度分析图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例一BHK21悬浮细胞基础代谢水平的研究以及BHK-21细胞悬浮培养流加培养基的建立1材料1.1BHK-21细胞悬浮培养BHK-21细胞工作细胞库，批号为BHK-21/W/S-201201。1.2培养基ZN-MEM培养基，按照申请号为201510980603.7，专利技术名称为“一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在口蹄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于BHK‑21细胞流加培养的浓缩培养液，其特征在于由以下含量的各原料物质组成：

【技术特征摘要】
1.一种适用于BHK-21细胞流加培养的浓缩培养液，其特征在于由以下含量的各原料物质组成：2.如权利要求1所述的浓缩培养液，其特征在于由以下含量的各原料物质组成：3.权利要求1或2所述的浓缩培养液在BHK-21细胞培养中的应用。4.一种BHK-21悬浮细胞高密度流加培养方法，其特征在于利用生物反应器进行流加培养，所用培养基为调整后的ZN-MEM基础培养基，在细胞培养过程中，补加权利要求1或2所述的培养液，继续培养，收获细胞；所述的调整后的ZN-MEM基础培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：①氨基酸部分，包括：②平衡盐部分，包括：③维生素部分，包括：④其它添加物，包括：优选的，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：①氨基酸部分，包括：②平衡盐部分，包括：③维生素部分，包括：④其它添加物，包括：5.如权利要求4所述的方法，其特征在于以初始接种密度0.4～0.5×106个/ml向调整后的ZN-MEM基础培养基中接种复苏后的BHK-21细胞，培养参数：温度为36.5～37.0℃，pH值为6.8～7.0，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为100～120r/min；在细胞培养至24-36h，细胞生长密度达到1.5×106个/ml以上时，开始补加权利要求1或2所述的培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h-60h，再补加原培养基体积2％的权利要求1或2所述的培养液；培养至...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘学荣，武发菊，安芳兰，董文教，葛玉凤，陶世宇，杨进才，张云德，
申请(专利权)人：中农威特生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62