一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品依次与包被抗原、单抗和酶标记抗体反应后，再与参考阳性样品和阴性样品对比，即可用来评价猪口蹄疫病毒的特异性IgA抗体水平；并提供了其检测试剂盒。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供了一种评价口蹄疫黏膜免疫效果的有效方法，并为口蹄疫感染的早期诊断提供了一种新方法，能够快速、准确的检测猪鼻拭子中的口蹄疫病毒特异性IgA抗体，样品的采集操作简便，人力消耗小，对动物的应激小。

Method for detecting specific IgA antibody of O type foot-and-mouth disease virus of pigs and detection kit thereof

The invention discloses a method for detection of type O FMDV specific antibody IgA, the prokaryotic expression system of foot-and-mouth disease virus VP1 protein as antigen to mouse anti porcine IgA monoclonal antibody two antibody, enzyme labeled Goat anti mouse IgG antibody as the indicator, sample order and the antigen, antibody and enzyme labeled antibody response, with reference positive sample and negative sample comparison, can be used to evaluate the foot-and-mouth disease virus specific IgA antibody levels; and provides the detection kit. The invention has the advantages that the invention provides an effective method for evaluation of immune effect of foot-and-mouth disease mucosa, and provides a new method for early diagnosis of infection of foot-and-mouth disease, can quickly and accurately detect porcine nasal swabs of the foot-and-mouth disease virus specific IgA antibody, sample collection and simple operation human consumption, small, small animal stress.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫（Foot-and-MouthDisease,FMD）是由小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的动物疫病，家畜感染后生产性能下降，患病仔畜死亡率高。侵染对象主要是猪、牛、羊等畜种及其它偶蹄动物，易感动物多达70余种。该病一旦暴发就会给养殖业和国际动物产品贸易带来极大的经济损失，国际动物卫生组织（OIE）将其列在15个A类动物疫病名单之首，也是我国一旦发生必须上报的一类动物传染病之一。口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亚洲1型）7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一种血清型口蹄疫病毒的动物仍可感染另一血清型口蹄疫病毒而发病。在口蹄疫病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4中，VP1蛋白上不仅存在主要的抗原位点（141-160aa,200-213aa和21-40aa），而且含有FMD病毒的宿主识别位点。因此选择该区域基因构建表达载体表达纯化的蛋白可以作为良好的制备抗体检测试剂盒的备选包被抗原。IgA抗体作为黏膜免疫的主要效应因子，广泛存在于初乳、泪液、唾液等分泌液中，它不仅可以在第一时间中和病毒，而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应，进而阻止病毒的侵入。其主要功能有:阻抑黏附，免疫排除，溶解细菌，中和病毒，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC,antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity），抗炎症，促进天然因子作用及调节黏膜免疫反应。抗口蹄疫病毒的IgA抗体是口蹄疫病毒感染或者疫苗黏膜免疫后首先在呼吸道和消化道产生特异性的标志，同时也反应了黏膜免疫疫苗的效果。目前市场上还没有能够有效检测口蹄疫病毒特异性IgA抗体的试剂盒，鉴于近年来对黏膜免疫机制和黏膜免疫疫苗研究的深入，开发一种检测黏膜分泌物中口蹄疫病毒特异性IgA抗体水平的ELISA试剂盒，能够更加准确地反应口蹄疫病毒感染和黏膜免疫状态，同时利用该方法监测口蹄疫病毒特异性IgA抗体动态变化规律，为口蹄疫黏膜免疫效果评价和免疫程序优化提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品与包被抗原反应后，再通过单抗和酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性样品和阴性样品对比，即可用来评价猪口蹄疫病毒的特异性IgA抗体水平。进一步的，上述的一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，包括以下步骤：1)包被抗原的制备与包被：将O型FMDV-VP1蛋白的639bP片段克隆到pET-30a(+)原核表达载体，经酶切、测序正确后，转化到E.coliBL-21(E3)，经IPTG诱导表达出VP1蛋白，用Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，经该原核表达系统表达的纯化产物，用碳酸盐缓冲液将抗原稀释成4μg/mL，取100μl/孔的量加到96孔酶标板上，4℃包被过夜；2)酶联板的封闭与保存：步骤1)得到的包被过夜的酶标板用PBST洗涤4次，最后一次拍干，每孔加入100μl含6％马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，采用铝箔袋真空封口，4℃保存；3)参考阴阳性样品的制备：采集O型口蹄疫病毒攻毒后7-21d猪的样品，经混合、一系列稀释后检测OD450值为1.5±0.05的样品为阳性；采集口蹄疫阴性猪不同时间段的样品，经混合、稀释后检测OD450值为0.15±0.05的样品为阴性，无菌分装备用；4)二抗和酶标抗体浓缩液的制备：鼠抗猪IgA单抗用含25％甘油的样品稀释液100倍稀释后4℃保存，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体用酶标抗体稳定剂100倍稀释后4℃保存；5)样品中口蹄疫病毒特异性IgA抗体的检测：步骤2)得到的酶标板上，每孔加入稀释后的待检样品100μL，同时加入阴阳性对照各两孔，37℃孵育30min，样品稀释方法为：样品按1:2稀释，即先在稀释板中加50μl样品稀释液，再加50μl被检样品；取出酶标板，用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL步骤4)得到的稀释的鼠抗猪IgA单克隆抗体，37℃孵育30min；取出酶标板，用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL步骤4)得到的HRP标记的且稀释过的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育30min；取出酶标板，用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL的TMB显色液，室温反应10min后加入100μL/孔1moL/L的硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值；6)数据对比分析：将被检样品的OD450nm值大于等于阴性平均值的2.5倍判为阳性，小于阴性平均值的2.5倍判为阴性，然后对样品阴阳性进行统计分析。进一步的，上述的一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，所述参考阳性样品是实验室攻毒后7-21天感染口蹄疫的猪的鼻拭子样品，阴性样品是经PrioCHECKFMDVNS试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，A型、O型、AsiaI口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测血清抗体效价<1/4，FMDV特异性PCR检测抗原为阴性猪的鼻拭子；待检样品为猪的鼻拭子。本专利技术的第二个目的是提供了一种猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒是采用上述的检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法进行检测。进一步的，上述的猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中包括有：预包被抗原的酶标板、阳性参考、阴性参考、样品稀释液、100倍鼠抗猪IgA单抗浓缩液、100倍酶标抗体浓缩液、PBST（10×）、TMB显色液和终止液。本专利技术的技术要点为：1、以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品与包被抗原反应后，通过单抗和酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性鼻拭子和阴性鼻拭子对比，来评价猪口蹄疫病毒特异性IgA抗体水平。2、包被抗原是经大肠杆菌pET-30a（＋）)原核表达后纯化的VP1蛋白，该蛋白含有口蹄疫病毒主要抗原位点（141-160aa,200-213aa和21-40aa），而且含有FMD病毒的宿主识别位点（RGD三肽基序）。3、二抗是鼠抗猪IgA单克隆抗体，三抗是HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。4、参考阳性样品是实验室攻毒后7-21天感染口蹄疫的猪的鼻拭子，阴性样品是经PrioCHECKFMDVNS试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性；A型、O型、AsiaI口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测血清抗体效价<1/4；FMDV特异性PCR检测抗原为阴性猪的鼻拭子。本专利技术的有益效果为：本专利技术公开了一种检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品与包被抗原反应后，再通过单抗和酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性样品和阴性样品对比，即可用来评价猪口蹄疫病毒的特异性IgA抗体水平。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品与包被抗原反应后，再通过单抗和酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性样品和阴性样品对比，即可用来评价猪口蹄疫病毒的特异性IgA抗体水平。2.根据权利要求1所述的一种检测猪O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）包被抗原的制备与包被：将O型FMDV-VP1蛋白的639bP片段克隆到pET-30a（＋）原核表达载体，经酶切、测序正确后，转化到E.coliBL-21（E3），经IPTG诱导表达出VP1蛋白，用Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，经该原核表达系统表达的纯化产物，用碳酸盐缓冲液将抗原稀释成4μg/mL，取100μl/孔的量加到96孔酶标板上，4℃包被过夜；2）酶联板的封闭与保存：步骤1）得到的包被过夜的酶标板用PBST洗涤4次，最后一次拍干，每孔加入100μl含6%马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，采用铝箔袋真空封口，4℃保存；3）参考阴阳性样品的制备：采集O型口蹄疫病毒攻毒后7-21d猪的样品，经混合、一系列稀释后检测OD450值为1.5±0.05的样品为阳性；采集口蹄疫阴性猪不同时间段的样品，经混合、稀释后检测OD450值为0.15±0.05的样品为阴性，无菌分装备用；4）二抗和酶标抗体浓缩液的制备：鼠抗猪IgA单抗用含25%甘油的样品稀释液100倍稀释后4℃保存，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体用酶标抗体稳定剂100倍稀释后4℃保存；5）样品中口蹄疫病毒特异性IgA抗体的检测：步骤2）得到的酶标板上，每孔加入稀释后的待检样品100μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘丽，张中旺，吕建亮，王园园，周鹏，王永录，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62