本发明专利技术公开了一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。所述的O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1以及优化后的VP3结构蛋白组装而成，其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术尝试将口蹄疫病毒结构蛋白VP3的部分区段进行人工缺失，结果显示，VP3基因经人工缺失后，VP3目的蛋白的表达量较突变前提高了20％，病毒样颗粒的组装效率提高了15％左右，且动物试验结果表明其免疫原性良好，与未缺失VP3组装得到的VLPs无显著差别。本发明专利技术的提出为口蹄疫疫苗的研制提供了一种新的技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途，属于农业科学畜牧兽医科学
技术介绍
动物病毒病的暴发流行往往严重影响整个国家的畜产品生产和出口贸易，如口蹄疫病毒，其引起的偶蹄动物烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首，在国家动物疫病防治长期发展规划中确定为首位限期免疫净化防控的病种。目前国内外主要使用全病毒灭活疫苗等传统疫苗对口蹄疫等病毒性传染病进行免疫防控，但防疫效果不尽人意。这类疫苗因生产成本较高、疫苗生产过程中或灭活不彻底可能造成散毒的生物安全问题，以及筛选匹配疫苗株周期长等缺点，已不能完全满足动物疫病防控目标中彻底净化的要求。因此，研发新型、安全、高效的基因工程疫苗制剂是目前的当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病、保障畜牧业健康可持续发展的战略需求。病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)是近年来新出现的一种基因工程亚单位形式，其优点包括不含病毒复制所必须的遗传物质，生物安全性优越；可以模拟病毒的天然结构而使构象依赖型抗原表位得以正确呈现；能像自然病毒粒子一样与细胞表面受体结合进入细胞，从而诱导较强的免疫反应；在不影响VLPs结构的基础上可以根据需要插入或删除某些氨基酸序列，对其进行人工改造，从而实现对多种病毒同时免疫的多效性特点等。因此，VLPs作为疫苗，被认为是目前能够替代全病毒疫苗的最佳候选疫苗形式。尽管VLPs研究从20世纪五六十年代开始相继出现报道，但大多VLPs的研究都集中在真核表达系统中，尤其是杆状病毒/昆虫表达系统，虽然已出现利用该系统获得的商品化人类VLPs疫苗，但由于该系统生产成本高、VLPs产率低等因素限制了动物病毒VLPs疫苗的产业化进程，至今还未出现商品化动物病毒VLPs疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的O型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：原核表达系统生产VLPs，其优势是费用低廉，蛋白产率高，容易满足大规模生产。鉴于此，本专利技术则在前期建立的原核表达组装技术平台基础上，为了进一步提高O型口蹄疫病毒VLPs的蛋白表达效果及组装率，通过对口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3基因的剪切优化，进一步提高了O型口蹄疫病毒衣壳蛋白的表达水平，并且经测定VP3的改变不影响VLPs的组装，且其组装效率高于未缺失VP3的自然VLPs的组装。并且优化后的病毒样颗粒，能够保持持久的刺激使动物机体产生特异性抗体以及中和抗体，与未缺失VP3组装得到的VLPs无显著差别。具体的，本专利技术的一种O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1以及优化后的VP3结构蛋白组装而成，其中VP1的基因序列为SEQIDNO.1所示，VP0的基因序列为SEQIDNO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示。进一步的，本专利技术还公开了一种构建O型口蹄疫病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体pSMA；(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建根据GenBank中公布的登陆号为JN998085.1的O型口蹄疫病毒序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0、VP1及VP3；以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA3’VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG3’VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC3’VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC3’VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG3’VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC3’采用聚合酶链式反应的方法，分别用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R，扩增获得VP1、VP0以及VP3基因片段，将扩增得到的VP3基因缺失574-615位的核苷酸序列，即获得优化后的VP3的基因序列，命名为optiVP3；扩增获得的VP1、VP0以及optiVP3基因片段分别经BsmBI/BamHI双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK或pSMA，所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0，pSMK/VP1以及pSMA/optiVP3，以pSMK/VP1为模板，以T7BamHI/VP1XhoI为引物扩增获得含T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamHI/XhoI双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，所得双表达重组载体命名为pSMK/VP0-VP1；所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列为：T7BamHI：5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA3’VP1XhoI：5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG3’(3)衣壳蛋白的表达及纯化将表达载体pSMA/optiVP3与pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21(DE3)，用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆进行蛋白表达和纯化；(4)口蹄疫病毒样颗粒体外组装用小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白，通过HisTrapHP除去小泛素样修饰标签蛋白，收集含有VP0、VP1以optiVP3的流穿液，在含有500mMNaCl，pH8.0的20mMTris-HCl组装缓冲液中，4℃过夜组装成O型口蹄疫VLPs。在本专利技术中，优选的，所述的VP1的基因序列为SEQIDNO.1所示，VP0的基因序列为SEQIDNO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示。更进一步的，本专利技术还提出了所述的O型口蹄疫病毒样颗粒在制备口蹄疫疫苗中的用途。相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术尝试将口蹄疫病毒VP3的部分区段进行人工缺失，以期提高目的蛋白的表达量及病毒样颗粒的组装效率，为进一步推进病毒样颗粒疫苗的研究和应用，加速动物疫苗由传统灭活苗向基因工程苗转化的步伐提供技术支持。结果显示，VP3基因经人工缺失后，VP3目的蛋白的表达量比突变前提高了20％，病毒样颗粒的组装效率提高了15％左右，且免疫学检测发现反应原性与未缺失VLPs无区别。本专利技术为优化口蹄疫VLPs的获得进行了一次新的尝试和创新。附图说明图1为融合蛋白诱导表达及纯化；注：泳道1：Marker；泳道2：未突变诱导后的样品；泳道3：未突变诱导后的上清；泳道4-7：纯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种O型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于所述的O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1以及优化后的VP3结构蛋白组装而成，其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种O型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于所述的O型口蹄疫病毒样颗粒是由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1以及优化后的VP3结构蛋白组装而成，其中VP1的基因序列为SEQIDNO.1所示，VP0的基因序列为SEQIDNO.2所示，优化后的VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示。2.一种构建O型口蹄疫病毒样颗粒的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体pSMA；(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建根据GenBank中公布的登陆号为JN998085.1的O型口蹄疫病毒序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0、VP1及VP3；以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA3’VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG3’VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC3’VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC3’VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG3’VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC3’采用聚合...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，郭慧琛，杜平，靳野，张韵，魏衍全，朱向涛，刘湘涛，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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