一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用。通过转肽酶剪切制备疫苗，实验结果表明，该方法简单方便、工艺稳定，所制备的嵌合VLP用作疫苗能有效激活保护性免疫反应，产生很高的中和抗体滴度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体地说，本专利技术涉及一种新型的疫苗生产技术，采用新的抗原展示技术，通过蛋白剪切把抗原展示到VLPs表面，以生产疫苗。
技术介绍
病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)是一种重要的疫苗工具。VLPs可以模拟病毒的感染，而且带有病毒的抗原，可以产生有效的免疫保护。再加上VLP不含有病毒的基因组，因此非常安全。此外，VLPs还有一个广泛的应用就是作为载体，展示异质抗原[1]。目前，在VLPs上展示异质抗原，主要有两种方法：基因融合表达、化学偶联[2]。通过基因融合，可以把抗原和VLP融合表达，目的抗原就能展示在VLP表面。要生产不同疫苗，都需要从克隆开始，到表达，再到VLPs纯化，周期很长。化学偶联包括非共价结合和共价交联。非共价结合通过受体配体相互作用、链霉亲和素和生物素的高亲和力，把抗原结合在VLPs表面，但是这种方法产生的VLPs不一定有保护作用[3]。共价交联需要特异性修饰特定氨基酸，比如赖氨酸，使得氨基酸拥有活性基团，通过化学反应，把抗原共价结合到VLPs表面。化学反应可以在同一个VLPs上偶联不同抗原，发挥了VLPs展示平台多样性的优势。不过化学反应特异性不是很高，可能导致偶联的抗原构象不对，加上化学反应效率不理想[4]，可能降低抗原活性[5]，过程复杂等限制性因素，导致这种方法不是很理想。因此本领域技术人员致力于开发新型简单、高效、方法可靠、工艺稳定的在VLPs上展示异质抗原的的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合VLP(病毒样颗粒)，所述嵌合VLP具有式I所示结构的多肽：A-B-C(I)其中，元件A为载体蛋白；元件B为转肽酶识别基序；元件C为外源抗原肽；“-”表示连接上述各元件的共价键或接头。在另一优选例中，所述VLP选自下组：乙肝病毒病毒样颗粒、噬菌体Qβ病毒样颗粒、噬菌体MS2病毒样颗粒、豇豆花叶病毒样颗粒、人戊肝病毒样颗粒、和人肠道病毒E71病毒样颗粒等。在另一优选例中，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白(hepatitisBcoreprotein)或其片段(如50-120个氨基酸长度的多肽)。在另一优选例中，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白的N核心片段。在另一优选例中，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白的第1-79位氨基酸组成的多肽。在另一优选例中，所述转肽酶为转肽酶A。在另一优选例中，所述基序为LPXTG基序，优选地为LPETGG基序。在另一优选例中，所述元件A与所述元件C来自不同的物种。在另一优选例中，所述元件C为具有外源抗原表位的抗原肽。在另一优选例中，所述外源抗原选自：人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒(如肠道病毒EV71)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、引起自身免疫性疾病的抗原。在另一优选例中，所述自身免疫性疾病选自：自身免疫性关节炎、风湿性心脏病、系统性红斑狼疮、系统性血管炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血等。在另一优选例中，所述元件C选自：人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽gBAD-4、肠道病毒EV71抗原肽SP55、和肠道病毒EV71抗原肽SP70、结核杆菌CFP-10(antigenculturefiltrateprotein10，CFP-10)、自身免疫关节炎IL-Ra蛋白(IL-1receptorantagonist(IL-1Ra))等。在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示，优选地，所述元件A的编码多核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述元件C的序列如SEQIDNO.:5、、SEQIDNO.:6、或SEQIDNO.:7所示。在另一优选例中，所述共价键为肽键。在另一优选例中，所述嵌合VLP具有2种以上的式I所示的多肽，其中不同的多肽具有相同的元件A和元件B，以及不同的元件C。在另一优选例中，所述元件C的N端具有3～5个甘氨酸。本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的VLP。在另一优选例中，所述多核苷酸不包含编码元件C的序列。本专利技术的第三方面，提供了一种载体，它含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体为质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本专利技术第三方面所述的载体或基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如CHO细胞、NS0细胞、或293细胞)。本专利技术的第五方面，提供了一种组合物，所述组合物中包括(1)本专利技术第一方面所述的VLP、本专利技术第二方面所述的多核苷酸、和/或本专利技术第三方面所述的载体，和(2)药用辅料(如药学上可以接受的载体、赋形剂、佐剂等)。在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。在另一优选例中，所述组合物为疫苗组合物。本专利技术的第六方面，提供了本专利技术第一方面所述的VLP、本专利技术第二方面所述的多核苷酸、本专利技术第三方面所述的载体的用途，用于制备疫苗；或者用于制备针对所述外源抗原肽的抗体。在另一优选例中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或抗血清。本专利技术的第七方面，提供了一种制备本专利技术第一方面所述的嵌合VLP的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供病毒样颗粒，其中，至少一种构成所述病毒样颗粒的多肽C端具有转肽酶识别基序；(2)提供外源抗原肽，其中，所述抗原肽的N端具有3～5个(优选为3个)甘氨酸；和(3)嵌合反应，提供转肽酶，并配制反应体系进行嵌合反应从而制得所述嵌合VLP；所述反应体系中包括：步骤(1)提供的所述病毒样颗粒、步骤(2)提供的所述抗原肽、和所述转肽酶。在另一优选例中，所述反应体系中，病毒样颗粒：抗原肽：转肽酶的摩尔量比为:30μM～50μM：50μM～100μM：120μM～500μM。在另一优选例中，所述反应体系中反应时间为0.5小时～2小时。在另一优选例中，所述病毒样颗粒为乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒，并且所述病毒样颗粒包括分成两段的N核心多肽片段和C核心多肽片段。在另一优选例中，所述N核心多肽片段的C端具有转肽酶识别基序。在另一优选例中，所述N核心多肽片段为乙肝病毒核心抗原的第1－79位氨基酸残基构成的多肽。在另一优选例中，所述C核心多肽片段为乙肝病毒核心抗原的第80－185位氨基酸残基构成的多肽。在另一优选例中，所述抗原肽为具有病毒抗原表位的抗原肽。在另一优选例中，所述外源抗原选自：人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒(如肠道病毒EV71)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、自身免疫性关节炎(任意已知抗原在N端加入3～5个甘氨酸均可展示)。在另一优选例中，所述抗原肽选自：人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽gBAD-4、肠道病毒EV71抗原肽SP55、和肠道病毒EV71抗原肽SP70、结核杆菌CFP-10(antigenculturefiltrateprotein10，CFP-10)、自身免疫关节炎IL-Ra蛋白(IL-1receptorantagonist(IL-1Ra))等。应理解，在本专利技术范围内中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合VLP(病毒样颗粒)，其特征在于，所述嵌合VLP具有式I所示结构的多肽：A‑B‑C        (I)其中，元件A为载体蛋白；元件B为转肽酶识别基序；元件C为外源抗原肽；“‑”表示连接上述各元件的共价键或接头。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合VLP(病毒样颗粒)，其特征在于，所述嵌合VLP具有式I所示结构的多肽：A-B-C(I)其中，元件A为载体蛋白；元件B为转肽酶识别基序；元件C为外源抗原肽；“-”表示连接上述各元件的共价键或接头。2.如权利要求1所述的嵌合VLP，其特征在于，所述VLP选自下组：乙肝病毒病毒样颗粒、噬菌体Qβ病毒样颗粒、噬菌体MS2病毒样颗粒、豇豆花叶病毒样颗粒、人戊肝病毒样颗粒、和人肠道病毒E71病毒样颗粒等；优选地，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白(hepatitisBcoreprotein)或其片段(如50-120个氨基酸长度的多肽)。3.如权利要求1所述的嵌合VLP，其特征在于，所述元件C为具有外源抗原的抗原表位的抗原肽；优选地，所述外源抗原选自：人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒(如肠道病毒EV71)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、引起自身免疫性疾病的抗原。4.如权利要求1所述的嵌合VLP，其特征在于，所述元件C的N端具有3～5个甘氨酸。5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱志康，汤书兵，宣宝琴，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31