检测猴痘病毒的新型方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了检测猴痘病毒的新型方法及试剂盒。本发明专利技术提供的检测方法及试剂盒，能够特异性识别猴痘病毒的特异性序列，灵敏度高，最低检测限可达到100个DNA拷贝/μL，特异性高且稳定性好，操作方便，耗时短，适合于对猴痘病毒的现场监测。毒的现场监测。

【技术实现步骤摘要】
检测猴痘病毒的新型方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学
，更具体地，本专利技术涉及一种检测猴痘病毒的新型方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]猴痘(Monkeypox,MPX)是由猴痘病毒(Monkeypox Virus,MPV,MPXV, hMPXV)所引起的一种疾病，症状类似于天花。一个快速、高效以及便于家庭使用的MPXV检测方法对于即时发现并通报疑似病例至关重要。
[0003]正痘病毒科包括正痘病毒属、痘苗病毒属、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、野兔痘病毒属、猪痘病毒属等。正痘病毒科为病毒粒最大的一类DNA病毒，结构复杂。病毒粒呈砖形或椭圆形。有核心、侧体和包膜。核心含有与蛋白结合的病毒DNA。DNA为线型双链，鸟嘌呤和胞嘧啶的碱基含量低。病毒粒中有30种以上的结构蛋白和几种酶，核心蛋白中含依赖于 DNA的RNA多聚酶。病毒在细胞质内增殖，形成包涵体，病毒粒由微绒毛或由细胞裂解而释放。正痘病毒科包括脊椎动物痘病毒和昆虫痘病毒2亚科。猴痘病毒与天花病毒、牛痘病毒同属正痘病毒科，是双链DNA病毒。亲缘关系较为近的种属，在检测时难以避免地发生交叉反应，从而影响了检测和判断的准确性。
[0004]目前常使用传统的PCR或实时荧光PCR技术检测猴痘，但整个流程依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂以及需要专业的人员操作，通常需要至少90分钟才能得到测试结果，不能满足快速检测的需求。
[0005]重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术操作方便，适合于现场检测。短短几年，该技术蓬勃发展。然而，对于猴痘病毒等此类病毒的检测较难实现RPA检测，本领域至今没有获得检测猴痘的适合的RPA试剂。主要原因是：RPA扩增引物和探针的设计不同于普通PCR 或qRT
‑
PCR，PCR引物并不能直接用于RPA检测，RPA引物比一般PCR 引物长。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA 引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。可见RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前没有一种统一的设计标准，也无法用引物设计软件直接得到，人工设计的难度较大，成功率较低，需要大量的摸索和测试才能获得理想的引物和探针。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种对猴痘病毒进行检测的试剂、试剂盒及其检测方法，以解决现有的猴痘病毒检测困难的问题。本专利技术的试剂、试剂盒及其检测方法能够特异性识别猴痘病毒的特异性序列，特异性高且稳定性好，灵敏度高，检测下限可达到100个DNA拷贝/μL或更低，操作方便，耗时短，适合于对猴痘病毒的现场监测。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供一种基于重组酶聚合酶扩增的猴痘病毒检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)获得待测样品的DNA提取物；(2)以(1) 为模板，进行重组酶聚合酶扩增反应，确定扩增产物中猴痘病毒的存在情况；其中，所述重组酶聚合酶扩增反应的引
物和探针特异性扩增和检测猴痘病毒基因组中靶序列区域，以GenBank登录号MN702444作为基准序列时、该靶序列区域为其第187610～187837位。
[0008]在一种或多种实施方式中，当以GenBank中其它登录号的猴痘病毒基因组作为基准序列时，该靶序列区域的起始位点和终止位点可能是变化的。但根据序列保守性规则、或根据序列同一性分析，可以在GenBank中其它登录号的猴痘病毒基因组中找到相应于该“第187610～187837位”的序列区域。
[0009]在一种或多种实施方式中，以其中第187611～187643位、187806～187837 位作为引物设计的靶序列。
[0010]在一种或多种实施方式中，以其中第187700～187750位作为探针设计的靶序列。
[0011]在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，所述反应选自：实时荧光重组酶聚合酶扩增法、重组酶聚合酶扩增
‑
Cas12a法或重组酶聚合酶扩增
‑
试纸条法；较佳地，所述引物为SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0012]在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，所述反应为实时荧光重组酶聚合酶扩增法，所述探针为SEQ ID NO:3所示的探针，其内部含荧光基团、淬灭基团且含碱基替代物(碱基核苷酸类似物)，3
’
端设置聚合酶延伸阻断基团。较佳地，扩增反应后，还包括：利用实时荧光检测仪检测扩增产物，根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果。较佳地，判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，出现荧光值增加为阳性；无荧光值变化为阴性。
[0013]在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，所述反应为重组酶聚合酶扩增
ꢀ‑
Cas12a法，基于Cas12a切割ssDNA报告基因产生荧光信号，所述ssDNA报告基因携带荧光基团和猝灭基团；较佳地，反应体系中含有Cas12a、crRNA和 ssDNA报告基因；较佳地，Cas12a:crRNA:ssDNA报告基因的比值约为100: 125:50；较佳地，所述crRNA的DNA模板如SEQ ID NO:4所示；较佳地，所述ssDNA报告基因的序列为5
’‑
FAM
‑
TTTTT
‑3’
FQ。较佳地，扩增反应后，还包括：进行CRISPR
‑
Cas12a介导的切割实验，根据荧光变化判断扩增结果。较佳地，CRISPR
‑
Cas12a介导的切割实验的反应条件为：37
±
1℃反应10～ 30min。
[0014]在一种或多种实施方式中，步骤(2)中，所述反应为重组酶聚合酶扩增
‑ꢀ
试纸条法；其中，所述反向引物的一端以抗原标记物标记；所述探针为SEQID NO:3所示的探针，其5
’
端标记荧光基团、内部含有碱基替代物、3
’
端设置聚合酶延伸阻断基团。较佳地，扩增反应后，还包括：利用胶体金免疫层析试纸条技术显色，根据试纸条的检测带判断扩增结果。较佳地，判断扩增结果的方法为：观察试纸条的检测带，出现检测条带为阳性；无检测条带为阴性；较佳地，所述试纸条还包括质控带，当检测带和质控带都显示时为阳性，仅显示质控带时为阴性。
[0015]在一种或多种实施方式中，所述DNA提取物为稀释的DNA提取物，也可以为富集(浓缩)的DNA提取物。
[0016]在一种或多种实施方式中，所述待测样品来自携带病毒的对象。
[0017]在一种或多种实施方式中，所述携带病毒的对象包括：体外细胞，细胞培养物，分离的细胞，附着所述病毒或携带病毒的细胞的物质(如容器、场所、食品、饮料、保健品等等)、人、非人哺乳动物。
[0018]在一种或多种实施方式中，所述方法的检测下限为1拷贝(100)或更低。
[0019]在一种或多种实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于重组酶聚合酶扩增的猴痘病毒检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)获得待测样品的DNA提取物；(2)以(1)为模板，进行重组酶聚合酶扩增反应，确定扩增产物中猴痘病毒的存在情况；其中，所述重组酶聚合酶扩增反应的引物和探针特异性扩增和检测猴痘病毒基因组中靶序列区域，以GenBank登录号MN702444作为基准序列时、该靶序列区域为其第187610～187837位。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述反应选自：实时荧光重组酶聚合酶扩增法、重组酶聚合酶扩增
‑
Cas12a法或重组酶聚合酶扩增
‑
试纸条法；较佳地，所述引物为SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(a)所述反应为实时荧光重组酶聚合酶扩增法，所述探针为SEQ ID NO:3所示的探针，其内部含荧光基团、淬灭基团且含碱基替代物，3
’
端设置聚合酶延伸阻断基团；或(b)所述反应为重组酶聚合酶扩增
‑
Cas12a法，基于Cas12a切割ssDNA报告基因产生荧光信号，所述ssDNA报告基因携带荧光基团和猝灭基团；较佳地，反应体系中含有Cas12a、crRNA和ssDNA报告基因；较佳地，Cas12a:crRNA:ssDNA报告基因的比值约为100：125：50；较佳地，所述crRNA的DNA模板如SEQ ID NO:4所示；较佳地，所述ssDNA报告基因的序列为5
’‑
FAM
‑
TTTTT
‑3’
FQ；或(c)所述反应为重组酶聚合酶扩增
‑
试纸条法；其中，所述反向引物的一端以抗原标记物标记；所述探针为SEQ ID NO:3所示的探针，其5
’
端标记荧光基团、内部含有碱基替代物、3
’
端设置聚合酶延伸阻断基团。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(a)中，扩增反应后，还包括：利用实时荧光检测仪检测扩增产物，根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果；或(b)中，扩增反应后，还包括：进行CRISPR
‑
Cas12a介导的切割实验，根据荧光变化判断扩增结果；或(c)中，扩增反应后，还包括：利用胶体金免疫层析试纸条技术显色，根据试纸条的检测带判断扩增结果。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(a)中，判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，出现荧光值增加为阳性；无荧光值变化为阴性；或(b)中，CRISPR
‑
Cas12a介导的切割实验的反应条件为：37
±
1℃反应10～30min；或(c)中，判断扩增结果的方法为：观察试纸条的检测带，出现检测条带为阳性；无检测条带为阴性；较佳地，所述试纸条还包括质控带，当检测带和质控带都显示时为阳性，仅显示质控带时为阴性。6.一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其包含扩增和检测猴痘病毒基因组中靶序列区域的引物和探针，以GenBank登录号MN702444作为基准序列时、该靶序列区域为其第187610～187837位；所述引物和探针是用于重组酶聚合酶扩增反应的引物和探针；较佳地，所述引物为SEQ ID NO:1所示的正向引物、SEQ ID NO:2所示的反向引物。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应选自：实时荧光重组酶聚合酶扩增法、重组酶聚合酶扩增
‑
Cas12a法或重组酶聚合酶扩增
‑
试纸条法；较佳地，(a)所述反应为实时荧光重组酶聚合酶扩增法，所述探针为SEQ ID NO:3所示的探针，
其内部含荧光基团、淬灭基团且含碱基替代物，3
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端设置聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼古拉斯，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：