一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术提出了一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒和方法，其中试剂盒包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括基因多重反应液、酶混合液和核酸扩增反应液，所述基因多重反应液包括猴痘病毒F3L基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标GAPDH基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本发明专利技术试剂盒为预混反应液，避免了反应液和酶混合时带来的误差，减少了操作难度，极大提高了检测灵敏度；并且能同时对刚果盆地分支和西非分支进行有效检测。支进行有效检测。支进行有效检测。

【技术实现步骤摘要】
一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及PCR检测
，尤其涉及一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)属于痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，正痘病毒属，是一种人畜共患的双链DNA病毒，长约197kb，基因组两端都有闭合的发夹，具有反向末端重复序列，病毒体90％以上由蛋白质构成，含有100多种多肽以及10多种酶类。正痘病毒家族中还有天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、浣熊痘病毒等，猴痘及上述前3种病毒均可感染人类。猴痘病毒的形态、化学结构、抗原性、致病性以及对外界的抵抗性等，均和其他的痘病毒相似，需与天花、水痘相鉴别。基于猴痘病毒感染的临床表现和流行病学特征，并结合基因型研究，分为刚果盆地分支(CB)和西非分支(WA)。
[0003]我国《猴痘诊疗指南(2022年版)》将猴痘诊断类型分为疑似病例和确诊病例，诊断依据结合流行病史、临床表现和病原学检查，其中猴痘病毒核酸检测阳性为确诊病例病原学检查判断的重要依据。用临床标本进行实时荧光PCR试验，窗口期短，检测灵敏度高，特异性好，可从猴痘患者皮损标本中检测出猴痘基因组片段，为临床快速提供实验室诊断的依据。
[0004]CN114752711A公开了一种检测猴痘病毒CB和猴痘病毒WA的试剂盒，灵敏度(200拷贝/mL)较低，并且试剂盒的荧光PCR反应液和酶混合液分开，试剂盒的其它成分、反应体系以及样本的加入量都会影响检测分析敏感性、特异性以及检测重现性。因此，需要开发一种检测灵敏度，特异性好且能同时对刚果盆地分支和西非分支进行有效检测的试剂盒。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提出了一种检测灵敏度，特异性好且能同时对刚果盆地分支和西非分支进行有效检测的试剂盒。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒，包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括基因多重反应液、酶混合液和核酸扩增反应液，所述基因多重反应液包括猴痘病毒F3L基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标GAPDH基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，所述猴痘病毒F3L基因上游引物浓度为0.3
‑
0.5μmol/L、下游引物浓度为0.3
‑
0.5umol/L、探针浓度为0.1
‑
0.3umol/L；所述内参GAPDH基因上游引物浓度为0.1
‑
0.3umol/L、内参GAPDH基因下游引物浓度为0.1
‑
0.3umol/L、内参GAPDH基因探针浓度为0.1
‑
0.3umol/L。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，所述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示的探针
5'端均标记荧光基团，3'端均标记猝灭基团和PO4基团。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，所述荧光基团为HEX、JOE、VIC和ROX中的一种或多种，所述猝灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示的探针标记的荧光基团不一样。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶混合液包括Taq聚合酶和UNG酶。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述核酸扩增反应液包括MgSO4、Buffer缓冲液、dNTPs以及增强剂。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，其中增强剂包括甘油、BSA和TMAC。
[0014]在以上技术方案的基础上，优选的，所述阳性对照为猴痘病毒F3L基因片段的病毒样颗粒、GAPDH质粒颗粒和50％的TE Buffer，所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。
[0015]第二方面，本专利技术提供了一种用于以非诊断目的检测猴痘病毒的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
[0016]S1，提取或释放待测样本的核酸；
[0017]S2，使用上述试剂盒对S1获得的核酸进行荧光PCR分析；
[0018]S3，获得并分析结果。
[0019]本专利技术的一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：本专利技术试剂盒为预混反应液，避免了反应液和酶混合时带来的误差，减少了操作难度，极大提高了检测灵敏度。引入了锁核酸(LNA)探针，具有高识别能力和亲和力，可显著提高完全匹配和错配碱基之间的Tm值差异，能够更有效地分辨低至单个碱基之间的差异性，从而有效提高猴痘基因突变的检出率，特异性好，能同时对刚果盆地分支和西非分支进行有效检测。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为本专利技术的猴痘F3L基因和内参GAPDH基因荧光扩增曲线图；
[0022]图2为本专利技术试剂盒的灵敏度验证结果图；
[0023]图3为本专利技术的猴痘通道的荧光扩增曲线图；
[0024]图4为本专利技术试剂盒的特异性检测图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]实施例一
[0027]本专利技术的猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒，包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，预混反应液包括F3L/GAPDH基因多重反应液、酶混合液和核酸扩增反应液，所述基因多重反应液包括猴痘病毒F3L基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标GAPDH基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0028]其中，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示的探针5'端均标记荧光基团，3'端均标记猝灭基团和PO4基团。
[0029]荧光基团为HEX、JOE、VIC和ROX中的一种或多种，猝灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种。
[0030]SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括基因多重反应液、酶混合液和核酸扩增反应液，所述基因多重反应液包括猴痘病毒F3L基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标GAPDH基因上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。2.如权利要求1所述的一种猴痘病毒荧光PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述猴痘病毒F3L基因上游引物浓度为0.3
‑
0.5μmol/L、下游引物浓度为0.3
‑
0.5umol/L、探针浓度为0.1
‑
0.3umol/L；所述内参GAPDH基因上游引物浓度为0.1
‑
0.3umol/L、内参GAPDH基因下游引物浓度为0.1
‑
0.3umol/L、内参GAPDH基因探针浓度为0.1
‑
0.3umol/L。3.如权利要求1所述的一种猴痘病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示的探针5'端均标记荧光基团，3'端均标记猝灭基团和PO4基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，田潇然，王秀娟，肖樊，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：