本发明专利技术公开了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，所述伊马替尼靶向用药相关基因包括C‑kit和PDGFRA基因，该试剂盒包括分别用于检测C‑kit基因第9、11、13、17号外显子和PDGFRA基因第12、18号外显子的引物和荧光探针，通过荧光定量PCR扩增目的基因片段再进行测序反应，该试剂盒还包括虾碱酶和核酸外切酶I组成的消化酶系，PCR产物纯化效果更好且样品损失少。本发明专利技术试剂盒检测准确度及灵敏度高，重复性好，操作方便快捷，为伊马替尼靶向用药的测试、分析与评估提供了快速、可靠的实验依据。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒。
技术介绍
靶向药物(targetedmedicine)是目前最先进的用于治疗癌症的药物，它与传统药物最大的不同就在于其作用机理上。常规化疗药物是通过对细胞的毒害发挥作用，由于不能准确识别肿瘤细胞，因此在杀灭肿瘤细胞的同时也会殃及正常细胞，所以产生较大的毒副作用。而靶向药物是针对肿瘤基因开发的，它能够识别肿瘤细胞上由肿瘤细胞特有的基因所决定的特征性位点，通过与之结合(或类似的其他机制)，阻断肿瘤细胞内控制细胞生长、增殖的信号传导通路，从而杀灭肿瘤细胞、阻止其增殖。由于这样的特点，靶向药物不仅效果好，而且副作用要比常规的化疗方法小得多。使用靶向药物的治疗方法称为“靶向治疗”。胃肠道间质瘤(Gastrointestinalstromaltumors,GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤，依照目前的GIST诊断标准，新近流行病学研究显示发病率0.66～2.20/10万。GIST对传统化学治疗极不敏感，化疗药物有效率不足5％，进展期中位生存率仅约18个月。研究发现，干细胞因子表面的跨膜酪氨酸激酶受体C-kit和血小板源性生长因子受体(Platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR)基因的功能活化突变是GIST发生发展的关键，针对以上分子靶点的靶向药物伊马替尼在2001年被FDA批准用于GIST的治疗，改变了这一疾病的治疗策略。伊马替尼(Imatinibmesylate，商品名：格列卫，Glivec)是一种高效特异的酪氨酸激酶抑制剂，可以通过接合C-kit和PDGFRA的酪氨酸激酶活性中心，抑制其活性，进而达到治疗肿瘤的目的。在GIST中C-kit基因突变占75％-80％，PDGFRA基因突变占5％-10％，非C-kit和PDGFRA基因突变占10％-15％。不同的基因突变类型与胃肠道间质瘤靶向治疗的选择、伊马替尼剂量的评估、疗效及预后关系密切。已发现的C-kit基因突变类型有4种，9号外显子(5％-10％)、11号外显子(57％-71％)、13号外显子(约5％)和17号外显子(约5％)；PDGFRA基因突变类型主要有2种，12号外显子(约3％)和18号外显子(约97％)。临床研究表明，GIST中C-kit基因的突变情况与伊马替尼分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而C-kit基因为野生型时，伊马替尼的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高伊马替尼用药剂量可显著提高疗效。PDGFRA基因12号外显子及18号外显子发生突变的多数GIST患者对伊马替尼也很敏感，但PDGFRA基因18号外显子的D842V突变会导致GIST患者对伊马替尼原发耐药。因此，针对原发GIST或复发转移的GIST，明确其C-Kit和PDGFRA基因突变状态，对GIST进行精确的分子分型，筛选靶向药物伊马替尼适宜患者，根据基因突变类型推荐合理治疗剂量，是GIST个体化诊疗的重要环节。然而，现有市售的伊马替尼靶向用药相关基因C-kit或PDGFRA突变的试剂盒只能检测其中一种基因的突变，部分检测方法灵敏度低，不能准确检测出C-kit基因或PDGFRA基因是否发生突变，并且检测成本高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，可用来检测样本组织中C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，检测方便快捷，灵敏度高，并且检测成本较低。本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的引物探针组合物，所述伊马替尼靶向用药相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物1-12和荧光探针1-6，所述引物1-12的碱基序列分别为：引物15’-GCCACATCCCAAGTGTTTTATG-3’(SEQIDNO.1)引物25’-GAGCCTAAACATCCCCTTAAATTG-3’(SEQIDNO.2)引物35’-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3’(SEQIDNO.3)引物45’-ACCTATCAAAAGGGGCGCAA-3’(SEQIDNO.4)引物55’-GTTGTCTTCCTTCCTACAGGGAA-3’(SEQIDNO.5)引物65’-CAAGAGAGAACAACAGTCTGGGTAA-3’(SEQIDNO.6)引物75’-GTGAACATCATTCAAGGCGTACT-3’(SEQIDNO.7)引物85’-AAAATGTGTGATATCCCTAGACAGG-3’(SEQIDNO.8)引物95’-AAGCTCTGGTGCACTGGGACTT-3’(SEQIDNO.9)引物105’-ATTGTAAAGTTGTGTGCAAGGGA-3’(SEQIDNO.10)引物115’-ATGGCTTGATCCTGAGTCATTTC-3’(SEQIDNO.11)引物125’-CACTCAAACCTGGGCAATCT-3’(SEQIDNO.12)所述荧光探针1-6的碱基序列分别为：荧光探针15’-AGGCAGAAGTCTTGCCCACATCGTTG-3’(SEQIDNO.13)荧光探针25’-TACCCAAAAAGGTGACATGGAAAGCCC-3’(SEQIDNO.14)荧光探针35’-CCCTGGGTGCTGGAGCTTTCGG-3’(SEQIDNO.15)荧光探针45’-TCCTTTGCAGGACTGTCAAGCAGAGAATG-3’(SEQIDNO.16)荧光探针55’-AACCGAGGTATGAAATTCGCTGGAGG-3’(SEQIDNO.17)荧光探针65’-TCCACCGTGATCTGGCTGCTCG-3’(SEQIDNO.18)所述荧光探针1-6的5’端均连接有荧光基团，所述荧光探针的3’端均连接有能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团。引物1、2和荧光探针1用于检测C-kit基因的第9号外显子突变，引物3、4和荧光探针2用于检测C-kit基因的第11号外显子突变，引物5、6和荧光探针3用于检测C-kit基因的第13号外显子突变，引物7、8和荧光探针4用于检测C-kit基因的第17号外显子突变，引物9、10和荧光探针5用于检测PDGFRA基因的第12号外显子突变，引物11、12和荧光探针6用于检测PDGFRA基因的第18号外显子突变。本专利技术在对伊马替尼靶向用药相关基因C-kit和PDGFRA野生型序列和现有已知的所有突变型序列进行比对的基础上，针对突变频率比较高的C-kit基因第9号外显子、第11号外显子、第13号外显子和第17号外显子以及PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子各设计多对引物和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的引物探针组合物，其特征在于：所述伊马替尼靶向用药相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物1-12和荧光探针1-6，所述引物1-12的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.1-12所示，所述荧光探针1-6的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.13-18所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的引物探针组合物，其特征在于：所述伊马替尼靶向用药相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物1-12和荧光探针1-6，所述引物1-12的碱基序列分别如序列表中SEQIDNO.1-12所示，所述荧光探针1-6的碱基序列分别如序列表中SEQIDNO.13-18所示。
2.一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合物。
3.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针组合物中各引物浓度为0.3μmol/L，各荧光探针浓度为0.2μmol/L。
4.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液和测序...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，柳诚刚，曾海，肖樊，高峰英，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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