一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提出了一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法，包括：针对汉赛巴尔通体基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；针对结核杆菌基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；针对弓形虫基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。本发明专利技术可同时检测淋巴结炎中3种病原体的多重实时荧光定量PCR检测病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法，具有特异性好，检测速度快和效率高的优点。检测速度快和效率高的优点。检测速度快和效率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及PCR检测
，尤其涉及一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]淋巴结炎为淋巴结的良性病变，常由各种致病菌入侵机体受损皮肤或黏膜，或从其它感染病灶侵入相关部位的淋巴结造成，可以导致淋巴结炎发病的病原体有汉赛巴尔通体、结核杆菌和弓形虫等。汉赛巴尔通体，为革兰阴性短小棒状菌，有22个种和亚种，其中至少9种对人有致病性，常以淋巴结炎和发热为首发症状，大多数表现为亚临床感染和轻症感染而容易漏诊。结核杆菌，为主要的结核分枝杆菌复合群菌种。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中包括淋巴结核。弓形虫，属机会致病性原虫，寄生在人和多种动物的有核细胞内，为人兽共患寄生虫病。先天性弓形虫病临床表现复杂，多数婴儿出生时可无症状，其中部分于出生后发病；后天获得性弓形虫病病情轻重不一，免疫功能正常的宿主表现急性淋巴结炎最为多见，约占90％，且在人体多为隐性感染，其症状和体征又缺乏特异性，易造成误诊。
[0003]专利号为CN102312006A公开了汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法，并没有公开结核杆菌和弓形虫的检测，因此需要一种可以同时检测汉赛巴尔通体、核杆菌和弓形虫病原体的试剂盒和方法，以便及早明确病原，及早诊断以及合理指导临床用药。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种可以同时检测汉赛巴尔通体、结核杆菌和弓形虫的引物探针组、试剂盒和检测方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组合物，所述病原体包括汉赛巴尔通体、结核杆菌和弓形虫，所述引物探针组合物包括：
[0006]针对汉赛巴尔通体基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
[0007]针对结核杆菌基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
[0008]针对弓形虫基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，还包括内标基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述汉赛巴尔通体基因的探针和内标基因的探针的3
’
端均标记VIC，结核杆菌基因的探针和弓形虫基因的探针的3
’
端均标记FAM。
[0011]第二方面，本专利技术提供了一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的试剂盒，包括PCR第一反应液和PCR第二反应液，所述PCR第一反应液用于检测汉赛巴尔通体和结核杆菌，包括权利要求2所述的SEQ ID NO:1
‑
6的引物和探针；所述PCR第二反应液用于检测弓形虫和内标，包括权利要求2所述的SEQ ID NO:7
‑
12的引物和探针。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR第一反应液和PCR第二反应液均还包括PCR缓冲液、dNTP和dUTP。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，所述SEQ ID NO:1
‑
12中引物和探针的浓度均为8
‑
15μmol/L，dNTP浓度为8
‑
12mmol/L，dUTP浓度为90
‑
110mmol/L。
[0014]在以上技术方案的基础上，优选的，还包括酶混合液、阳性对照和阴性对照。
[0015]在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶混合液包括Taq酶和UNG酶。
[0016]在以上技术方案的基础上，优选的，所述Taq酶的浓度为3
‑
5U/μl，所述UNG酶的浓度为1
‑
2U/μl。
[0017]第三方面，本专利技术提供了引物探针组合物在制备用于检验淋巴结炎相关病原体的试剂盒中的应用，其中检测病原体的方法包括如下步骤：提供待测样本，向待测样本中加入上述的引物探针组合物，并进行实时荧光PCR扩增；根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定样本是否存在汉赛巴尔通体、结核杆菌和弓形虫基因。
[0018]本专利技术的一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组、试剂盒及检测方法相对于现有技术具有以下有益效果：本专利技术通过对汉赛巴尔通体、弓形虫、结核杆菌基因序列中一段特异性保守序列作为靶标序列设计引物、探针用于检测病原体，可根据需要随机进行两重、三重组合同时检测多种病原体，也可检测单个病原体；具有检测速度快、效率高的优点。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本专利技术试剂盒精密度结果图，以汉赛巴尔通体为例；
[0021]图2为本专利技术试剂盒特异性结果图，以弓形虫为例；
[0022]图3为本专利技术试剂盒检测限结果图，以弓形虫为例；
[0023]图4为本专利技术试剂盒特异性结果图，以其他病原体为例.
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]实施例一
[0026]本专利技术的多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组合物如表
1所示：
[0027]表1引物探针组合物
[0028][0029][0030]其中，汉赛巴尔通体基因的探针和内标基因的探针的3
’
端均标记VIC，结核杆菌基因的探针和弓形虫基因的探针的3
’
端均标记FAM。
[0031]其中内标为内源性的内标，根据人锚定蛋白重复区域53设计的内标引物和内标探针。
[0032]实施例二
[0033]本专利技术多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的试剂盒，包括PCR第一反应液和PCR第二反应液、酶混合液、内参、阳性对照和阴性对照。
[0034]PCR第一反应液用于检测汉赛巴尔通体和结核杆菌，包括SEQ ID NO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组合物，其特征在于：所述病原体包括汉赛巴尔通体、结核杆菌和弓形虫，所述引物探针组合物包括：针对汉赛巴尔通体基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；针对结核杆菌基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；针对弓形虫基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。2.如权利要求1所述的一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组合物，其特征在于：还包括内标基因的上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。3.如权利要求2所述的一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的引物探针组合物，其特征在于：所述汉赛巴尔通体基因的探针和内标基因的探针的3
’
端均标记VIC，结核杆菌基因的探针和弓形虫基因的探针的3
’
端均标记FAM。4.一种多重实时荧光定量PCR检测淋巴结炎相关病原体的试剂盒，其特征在于：包括PCR第一反应液和PCR第二反应液，所述PCR第一反应液用于检测汉赛巴尔通体和结核杆菌，包括权利要求3所述的SEQ ID NO:1
‑
6的引物和探针；所述PCR第二反应液用于检测弓形虫和内标，包括权利要求3所述的SEQ ID NO:7
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，尹璐，王秀娟，肖樊，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：