本发明专利技术提出了一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒，包括用于检测微卫星不稳定状态的引物组，所述引物组针对NR21、D5S346、NR24、BAT25、D17S250、MONO27、BAT26、D2S123、Penta D和TPOX这10个微卫星位点设计上下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO.1‑20所示，特异性强，覆盖范围广。本发明专利技术还提出了一种微卫星不稳定状态的检测方法，该检测方法基于多重荧光PCR技术和毛细管电泳技术，利用本发明专利技术试剂盒检测多个微卫星位点的不稳定状态，操作方便快捷，特异性和灵敏度高，重现性好，结果精准可靠。
A detection kit for microsatellite instability and its detection method
【技术实现步骤摘要】
一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
微卫星序列指核心序列为1至6个碱基的短串联重复结构，这些序列广泛分布在整个人类基因组中。当DNA错配修复功能受损时，可导致微卫星重复序列长度改变，这种现象称为微卫星不稳定(Micro-SatelliteInstability，MSI)。MSI是DNA修复缺陷型肿瘤细胞的特征之一，约15％的结直肠癌存在MSI。MSI检测被美国国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南及中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会(CSCO)结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结直肠癌患者，被NCCN胃癌临床实践指南推荐用于局部晚期、复发或转移的考虑用PD-1抑制剂治疗的胃癌患者。MSI检测可用于癌症患者肿瘤组织的MSI状态分析，为结直肠癌患者的诊断和预测免疫治疗疗效、初筛Lynch综合征患者、评估II期结直肠癌预后、预测II期结直肠癌辅助化疗疗效提供参考。1998年，美国国家癌症研究所(NCI)推荐了用于结直肠癌MSI，即为Bethesdapanel。2001年，研究者提出用BAT26单个位点分析结直肠MSI状态，其分析结果与Bethesdapanel高度一致。该研究表明Bethesdapanel时，仅存在双核苷酸MS位点“不稳定”时，不能立即判定为MSI-H，需分析额外的单核苷酸重复MS位点，以排除MSI-L，由此可知，要区分MSI-L与MSS需要更多的位点。2002年，基于双核苷酸重复MS位点的低灵敏性，单核苷酸重复MS位点的低特异性：单核苷酸重复MS位点的几近单态性，因此，NCI提出5个单核苷酸重复MS位点(BAT26、BAT25、NR21、NR22、NR24)用于MSI分析，判读标准为：≥3个位点检出不稳定判定为MSI-H。但是，如果激光系统不能完美校准，NR22在不同位点之间会产生干扰。2004年，修正后的Pentaplexpanel包括BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR27。2014年，NCI建议Bethesdapanel或Pentaplexpanel联合HT-17用于MSI状态分析，尤其针对大量正常DNA污染的样本。由此可知，NCI给出的判断标准可以联合使用。目前主要以PCR技术为基础研究微卫星不稳定性改变，较常用的是对选定的6个单碱基重复位点不稳定情况进行检测，无法检测所选定基因的其他多态性位点，检测不全面，判定结果并不可靠。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒及其检测方法，对10个微卫星位点(其中包括两个内参)进行了MSI状态分析，具体为5个单核苷酸重复位点和3个双核苷酸重复位点以及2个对照位点(四核苷酸重复位点和五核苷酸重复位点)，覆盖面积更广，提高了检测的准确性，不仅可以检测单碱基重复位点而且可以检测多核苷酸重复位点。本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种用于检测微卫星不稳定状态的引物组，包括针对微卫星位点NR21、D5S346、NR24、BAT25、D17S250、MONO27、BAT26、D2S123和PentaD设计的上下游引物，具体如下：NR21上游引物NR21-F1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.1所示，NR21上游引物NR21-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.2所示，D5S346上游引物D5S346-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.3所示，D5S346下游引物D5S346-R3的碱基序列如序列表中SEQIDNO.4所示，NR24上游引物NR24-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.5所示，NR24下游引物NR24-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.6所示，BAT25上游引物BAT25-F1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.7所示，BAT25下游引物BAT25-R2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.8所示，D17S250上游引物D17S250-F3的碱基序列如序列表中SEQIDNO.9所示，D17S250下游引物D17S250-R的碱基序列如序列表中SEQIDNO.10所示，MONO27上游引物MONO27-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.11所示，MONO27下游引物MONO27-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.12所示，BAT26上游引物BAT26-F3的碱基序列如序列表中SEQIDNO.13所示，BAT26下游引物BAT26-R2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.14所示，D2S123上游引物D2S123-F的碱基序列如序列表中SEQIDNO.15所示，D2S123下游引物D2S123-R2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.16所示，PentaD上游引物PentaD-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.17所示，PentaD下游引物PentaD-R4的碱基序列如序列表中SEQIDNO.18所示；所述上游引物NR21-F1、上游引物BAT25-F1、上游引物BAT26-F3和上游引物PentaD-F2均标记有第一荧光基团，所述上游引物D5S346-F2和上游引物D17S250-F3均标记有第二荧光基团，所述上游引物NR24-F2、上游引物MONO27-F2和上游引物D2S123-F均标记有第三荧光基团，所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测波长互不相同。在以上技术方案的基础上，优选的，所述用于检测微卫星不稳定状态的引物组还包括针对微卫星位点TPOX设计的上游引物TPOX-F1和下游引物TPOX-R1，所述上游引物TPOX-F1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.19所示，所述下游引物TPOX-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.20所示，所述上游引物TPOX-F1标记有第二荧光基团。本专利技术引入两个内参微卫星位点PentaD和TPOX的检测，用于更好地排除待测样本的外源DNA污染，提高结果的可信度。进一步，优选的，所述上游引物NR21-F1的5’端、上游引物BAT25-F1的5’端、上游引物BAT26-F3的5’端和上游引物PentaD-F2的5’端均标记有第一荧光基团，所述上游引物D5S346-F2的5’端、上游引物D17S250-F3的5’端和上游引物TPOX-F1的5’端均标记有第二荧光基团，所述上游引物NR24-F2的5’端、上游引物MONO27-F2的5’端和上游引物D2S123-F的5’端均标记有第三荧光基团。在以上技术方案的基础上，优选的，所述第一荧光基团为荧光基团FAM、VIC、NED、ROX和CY5中的任意一种，所述第二荧光基团为荧光基团FAM、VIC、NED、ROX和CY5中的任意一种，所述第三荧光基团为荧光基团FAM、VIC、NED、ROX和CY5中的任意一种。在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物组应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测微卫星不稳定状态的引物组，其特征在于，包括针对微卫星位点NR21、D5S346、NR24、BAT25、D17S250、MONO27、BAT26、D2S123和Penta D设计的上下游引物，具体如下：/nNR21上游引物NR21-F1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，/nNR21上游引物NR21-R1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，/nD5S346上游引物D5S346-F2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，/nD5S346下游引物D5S346-R3的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，/nNR24上游引物NR24-F2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，/nNR24下游引物NR24-R1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，/nBAT25上游引物BAT25-F1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.7所示，/nBAT25下游引物BAT25-R2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，/nD17S250上游引物D17S250-F3的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.9所示，/nD17S250下游引物D17S250-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.10所示，/nMONO27上游引物MONO27-F2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.11所示，/nMONO27下游引物MONO27-R1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.12所示，/nBAT26上游引物BAT26-F3的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.13所示，/nBAT26下游引物BAT26-R2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.14所示，/nD2S123上游引物D2S123-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.15所示，/nD2S123下游引物D2S123-R2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，/nPenta D上游引物Penta D-F2的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.17所示，/nPenta D下游引物Penta D-R4的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.18所示；/n所述上游引物NR21-F1、上游引物BAT25-F1、上游引物BAT26-F3和上游引物Penta D-F2均标记有第一荧光基团，所述上游引物D5S346-F2和上游引物D17S250-F3均标记有第二荧光基团，所述上游引物NR24-F2、上游引物MONO27-F2和上游引物D2S123-F均标记有第三荧光基团，所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测波长互不相同。/n...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测微卫星不稳定状态的引物组，其特征在于，包括针对微卫星位点NR21、D5S346、NR24、BAT25、D17S250、MONO27、BAT26、D2S123和PentaD设计的上下游引物，具体如下：
NR21上游引物NR21-F1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.1所示，
NR21上游引物NR21-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.2所示，
D5S346上游引物D5S346-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.3所示，
D5S346下游引物D5S346-R3的碱基序列如序列表中SEQIDNO.4所示，
NR24上游引物NR24-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.5所示，
NR24下游引物NR24-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.6所示，
BAT25上游引物BAT25-F1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.7所示，
BAT25下游引物BAT25-R2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.8所示，
D17S250上游引物D17S250-F3的碱基序列如序列表中SEQIDNO.9所示，
D17S250下游引物D17S250-R的碱基序列如序列表中SEQIDNO.10所示，
MONO27上游引物MONO27-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.11所示，
MONO27下游引物MONO27-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.12所示，
BAT26上游引物BAT26-F3的碱基序列如序列表中SEQIDNO.13所示，
BAT26下游引物BAT26-R2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.14所示，
D2S123上游引物D2S123-F的碱基序列如序列表中SEQIDNO.15所示，
D2S123下游引物D2S123-R2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.16所示，
PentaD上游引物PentaD-F2的碱基序列如序列表中SEQIDNO.17所示，
PentaD下游引物PentaD-R4的碱基序列如序列表中SEQIDNO.18所示；
所述上游引物NR21-F1、上游引物BAT25-F1、上游引物BAT26-F3和上游引物PentaD-F2均标记有第一荧光基团，所述上游引物D5S346-F2和上游引物D17S250-F3均标记有第二荧光基团，所述上游引物NR24-F2、上游引物MONO27-F2和上游引物D2S123-F均标记有第三荧光基团，所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测波长互不相同。
2.如权利要求1所述的用于检测微卫星不稳定状态的引物组，其特征在于：还包括针对微卫星位点TPOX设计的上游引物TPOX-F1和下游引物TPOX-R1，所述上游引物TPOX-F1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.19所示，所述下游引物TPOX-R1的碱基序列如序列表中SEQIDNO.20所示，所述上游引物TPOX-F1标记有第二荧光基团。
3.如权利要求2所述的用于检测微卫星不稳定状态的引物组，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，陶慧清，谢立群，吴琼，肖樊，周丹丹，高峰英，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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