一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用，用于检测样品中是否含有弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型核酸，该试剂盒包括用于检测这五种病原体核酸的引物对和荧光探针，还包括内标及用于检测内标的引物对和荧光探针，使用本发明专利技术试剂盒可以在两个PCR反应管里一次性上机同时检测五种病原体核酸，检测通量高，操作方便快捷，准确度和灵敏度高，不会出现假阳性和假阴性结果，并且大大降低了筛查成本。

A fluorescent quantitative PCR kit for simultaneous detection of five torch pathogens and its application

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用
本专利技术涉及病原体基因检测领域，尤其涉及一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用。
技术介绍
TORCH指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体，它是一组病原微生物的英文名称缩写，其中T(Toxopasma)是弓形虫，O(Others)是其他病原微生物，如梅毒螺旋体、带状疱疹病毒、细小病毒B19、柯萨奇病毒等，R(Rubella.Virus)是风疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)是巨细胞病毒，H(Herpes.Virus)是单纯疱疹病毒I/II型。这组微生物感染有着共同的特征，即可造成母婴感染。这些微生物可经过胎盘直接传播给胎儿，引起宫内感染，造成孕妇流产、死胎、畸胎或早产，新生儿出生后多器官损害、严重智力障碍；也可通过产道感染胎儿，导致出生后发育障碍，生活不可自理。主要特点是孕妇感染后无症状或症状轻，难以发现，是一种隐形杀手。其中单纯疱疹病毒(HSV)有二个血清型，即HSVI型和HSVII型，HSVI型主要感染腰部以上部位，引起口咽部疱疹、疱疹性角膜结膜炎、疱疹性甲沟炎或疱疹性脑炎等，儿童易感染；HSVII型主要感染生殖器。我国的HSV感染发病率迅速上升，近年HSVI型的感染显著增多，约占该病的10％-40％。HSVI型和HSVII型病毒核苷酸序列有50％同源性。由于HSVI型和HSVII型之间可以交叉感染，两型病毒的生物学特征及其各自引发的疾病和疾病的严重程度存在差异，如果检测结果不分型，则HSV阳性率会非常高，因为HSVI型有95％的人会感染且大多数为隐性感染，即HSV检测结果为阳性而没有任何症状，而HSVII型阳性率为3％-5％。另外，单纯疱疹病毒不同型感染，其治疗方案和预后也不同。因此，临床上提供分型诊断显得越来越重要。目前，我国临床上对TORCH病原体的检测仍以ELISA酶联免疫诊断技术为主。该方法是检测母体血清中的特异性IgM、IgG抗体。IgM阳性作为初次感染的诊断指标，IgG阳性看作是既往感染。目前潍坊市康华生物技术有限公司首次注册获得了TORCH相关检测试剂盒：TORCH-IgM(TOX-IgM、RV-IgM、CMV-IgM、HSVI-IgM、HSVII-IgM)五项联合检测试剂(胶体金法)和TORCH-IgG(TOX-IgG、RV-IgG、CMV-IgG、HSVII-IgG)四项联合检测试剂(胶体金法)。随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏性和高特异性，在临床检测中得到广泛应用。然而，由于弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒I/II型(HSVI/HSVII)等病原体的核苷酸序列具有重复序列多、GC含量较高及特异性短片段少，而特异性长片段的相互干扰严重等特点，一次性同时检测五种病原体难度很大；并且目前使用的PCR仪最多只有五个荧光检测通道，如果五个荧光通道全部用来检测TORCH五种病原体，除了对体系设计要求较高外，同时没有多余的检测通道用于内部质控检测，无法真实有效地监控待测样本核酸质量及核酸提取过程。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒及其应用。专利技术人经过长期大量的实验研究，摸索出合适的引物对和荧光探针序列、比例及工具酶和其浓度配比，使得可以在两个PCR反应管中一次性上机同时检测来自TORCH五种病原体的核酸，各种核酸扩增反应之间不会相互干扰，具有高准确度和高灵敏度，操作方便快捷，大大降低检测成本。本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒，包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述五种病原体分别为弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，所述第一PCR反应液包括其中三种病原体核酸的引物对和荧光探针，该三种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团，所述第二PCR反应液包括另外两种病原体核酸的引物对和荧光探针，该两种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记所述第一荧光基团和第二荧光基团，且所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测波长互不相同，所述五种病原体核酸的荧光探针3’端分别标记能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团，所述五种病原体核酸的引物对具体如下：TOX上游引物5’-CTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTG-3’(SEQIDNO.1)，TOX下游引物5’-GGAGCCGAAGTGCGTTTTCT-3’(SEQIDNO.2)；RV上游引物5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’(SEQIDNO.3)，RV下游引物5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’(SEQIDNO.4)；CMV上游引物5’-AAGGTCTTTGCCCAGTACATTCT-3’(SEQIDNO.5)，CMV下游引物5’-AATAGCCTCTTCCTCATCTGACTC-3’(SEQIDNO.6)；HSVI上游引物5’-CCTTCTTCTTGGCCTTGTGTT-3’(SEQIDNO.7)，HSVI下游引物5’-CCGGGAGATGATACGGTACAT-3’(SEQIDNO.8)；HSVII上游引物5’-TCGAGGAGGTGGTCTTGATGCG-3’(SEQIDNO.9)，HSVII下游引物5’-GCGGGAGTACATGCGGGAGC-3’(SEQIDNO.10)。荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAM、VIC、HEX、NED、TAMRA、CY3、ROX和CY5等常规标记基团，优选的，所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团分别为荧光基团FAM、HEX和CY5，所述五种病原体核酸的荧光探针具体如下：TOX荧光探针5’-CTCCAAGCACAGGCGAGCTTGC-3’(SEQIDNO.11)，TOX荧光探针5’端标记荧光基团CY5，3’端标记能够淬灭CY5荧光信号的淬灭基团；RV荧光探针5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’(SEQIDNO.12)，RV荧光探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团；CMV荧光探针5’-CCAGTACATTCTGGGGGCCGATC-3’(SEQIDNO.13)，CMV荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；HSVI荧光探针5’-TCTTGGCCTTGTGTTCCGTGCG-3’(SEQIDNO.14)，HSVI荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；HSVII荧光探针5’-TCTTGATGCGCTCCACGGACGCGTTG-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述五种病原体分别为弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，所述第一PCR反应液包括其中三种病原体核酸的引物对和荧光探针，该三种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团，所述第二PCR反应液包括另外两种病原体核酸的引物对和荧光探针，该两种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记所述第一荧光基团和第二荧光基团，且第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测波长互不相同，所述五种病原体核酸的荧光探针3’端分别标记能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团，所述五种病原体核酸的引物对如下：/nTOX上游引物5’-CTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTG-3’，/nTOX下游引物5’-GGAGCCGAAGTGCGTTTTCT-3’；/nRV上游引物5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’，/nRV下游引物5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’；/nCMV上游引物5’-AAGGTCTTTGCCCAGTACATTCT-3’，/nCMV下游引物5’-AATAGCCTCTTCCTCATCTGACTC-3’；/nHSVI上游引物5’-CCTTCTTCTTGGCCTTGTGTT-3’，/nHSVI下游引物5’-CCGGGAGATGATACGGTACAT-3’；/nHSVII上游引物5’-TCGAGGAGGTGGTCTTGATGCG-3’，/nHSVII下游引物5’-GCGGGAGTACATGCGGGAGC-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述五种病原体分别为弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，所述第一PCR反应液包括其中三种病原体核酸的引物对和荧光探针，该三种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团，所述第二PCR反应液包括另外两种病原体核酸的引物对和荧光探针，该两种病原体核酸的荧光探针5’端分别标记所述第一荧光基团和第二荧光基团，且第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团的荧光检测波长互不相同，所述五种病原体核酸的荧光探针3’端分别标记能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团，所述五种病原体核酸的引物对如下：
TOX上游引物5’-CTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTG-3’，
TOX下游引物5’-GGAGCCGAAGTGCGTTTTCT-3’；
RV上游引物5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’，
RV下游引物5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’；
CMV上游引物5’-AAGGTCTTTGCCCAGTACATTCT-3’，
CMV下游引物5’-AATAGCCTCTTCCTCATCTGACTC-3’；
HSVI上游引物5’-CCTTCTTCTTGGCCTTGTGTT-3’，
HSVI下游引物5’-CCGGGAGATGATACGGTACAT-3’；
HSVII上游引物5’-TCGAGGAGGTGGTCTTGATGCG-3’，
HSVII下游引物5’-GCGGGAGTACATGCGGGAGC-3’。


2.如权利要求1所述的同时检测TORCH五种病原体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述第一荧光基团、第二荧光基团和第三荧光基团分别为荧光基团FAM、HEX和CY5，所述五种病原体核酸的荧光探针如下：
TOX荧光探针5’-CTCCAAGCACAGGCGAGCTTGC-3’，
TOX荧光探针5’端标记荧光基团CY5，3’端标记能够淬灭CY5荧光信号的淬灭基团；
RV荧光探针5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’，
RV荧光探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团；
CMV荧光探针5’-CCAGTACATTCTGGGGGCCGATC-3’，
CMV荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；
HSVI荧光探针5’-TCTTGGCCTTGTGTTCCGTGCG-3’，
HSVI荧光探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团；
HSVII荧光探针5’-TCTTGATGCGCTCCACGGACGCGTTG-3’，
HSVII荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，杨雪婷，肖樊，许威，李志杰，瞿佳莉，高峰英，白旭，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42