一种用于检测PDGFRA基因热点突变的核苷酸组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测PDGFRA基因热点突变的核苷酸组、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。所述引物和探针，所述引物和所述探针包括用于检测所述PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物。所述试剂盒包括：上述引物和探针。本发明专利技术提供的引物和探针能够高灵敏地检测出PDGFRA基因是否发生突变，同时，采用锁核酸探针可以大大提高了检测PDGFRA基因突变的灵敏度，采用本发明专利技术提供的试剂盒能够准确检测PDGFRA基因是否突变。

【技术实现步骤摘要】
-种用于检测PDGFRA基因热点突变的引物、探针、锁核苷 酸探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于检测roGFRA基因突变的引物、探 针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
血小板源性生长因子受体a多肤（platelet-derivedgrowthfactorreceptor alpha，H)GFRA)是一种单链跨膜蛋白，属III型酪氨酸蛋白激酶家族。最常见的H)GFRA突 变位点是编码位于第二酪氨酸激酶区活化环的区域（exonlS)，少数突变发生在近膜区 (exonl2)，突变引起TOGFRA蛋白的功能改变，通常会导致非配体依赖性的二聚体形成、酪 氨酸残基自主磷酸化及下游信号的激活。这种激活导致的最终结果是肿瘤的发生。 现有的检测F^GFRA基因突变的方法有Sanger测序法，但采用Sanger测序法检测 TOGFRA基因突变时，其检测灵敏度低，不能准确检测出TOGFRA基因是否发生突变，使用者 迫切需要一种高灵敏度的检测方法替换Sanger测序法。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测roGFRA基因突变的方法的灵敏度低的问题，本专利技术实 施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方 法。所述技术方案如下： -方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的引物和探针，所述 用于检测TOGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测所述TOGFRA基因的第12号外显子 的引物和探针、以及用于检测所述TOGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一 种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中， TOGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示； TOGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示； TOGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQIDNO. 3所示； TOGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示； TOGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示； TOGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQIDNO. 6所示； 所述探针的5'端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3'端均连接有BHQ淬灭基 团。 另一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测roGFRA基因突变的锁核酸探针，所 述锁核酸探针包括： roGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQID NO. 7所示； TOGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQID NO. 8所示； 所述锁核酸探针的3'端均连接有PCM基团。 再一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测TOGFRA基因突变的试剂盒，所述试 剂盒包括：上述的引物和探针。 具体地，所述试剂盒还包括：如权利要求2所述的锁核酸探针。 具体地，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、 消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。 具体地，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5XPCR缓冲液5iil、2. 5mmol/LdNTPs 1. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。 具体地，所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶I。 具体地，所述测序反应液包括：3iimol/L所述TOGFRA基因第12号外显子的正向 弓丨物1111、311111〇1/1所述？06?狀基因第18号外显子的正向引物1111、0.31115\81 8(^ 和 0? 45ii1 2. 5XBuffer。 具体地，所述测序PCR产物纯化试剂包括0. 75mol/LNaCl和纳米磁珠。 又一方面，本专利技术实施例提供了一种检测TOGFRA基因突变的方法，采用上述的试 剂盒，所述方法包括： 提取样本的基因组DNA; 以获得的所述基因组DNA作为所述模板DNA，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应， 得到PCR扩增产物； 对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物； 将所述纯化的PCR扩增产物作为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产 物； 将所述测序PCR扩增产物进行纯化； 将纯化后的所述测序PCR扩增产物测序分析，并与所述TOGFRA基因对应的野生型 进行测序分析对比，判定所述样本中的所述TOGFRA基因是否发生突变。 本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的引物和探 针能够高灵敏地检测出TOGFRA基因是否发生突变，同时，锁核酸（Lockednucleicacid， LNA)是一种人工合成的反义寡核苷酸，其结构中0 -D-呋喃核糖的2' -0,4' -C位通过不同 的缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥刚性缩合结构，环形桥锁定 了呋喃糖C3' -内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳 定性，因此对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解。将锁核酸作为探 针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错 配可使RNA/DNA的熔解温度（Tm值）较大幅度地下降，采用锁核酸探针可以大大提高了检 测TOGFRA基因突变的灵敏度。本专利技术提供的试剂盒包括本专利技术实施例提供的引物、探针以 及锁核酸探针，使得本专利技术实施例提供的试剂盒具有高灵敏度。本专利技术实施例提供的检测 方法，能够准确检测TOGFRA基因是否突变，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行 扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变 型样本进行富集，能显著提高突变型的检测灵敏度。PCR扩增产物采用碱性磷酸酶和核酸外 切酶进行消化，这能有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，省去了凝胶 电泳的步骤，不但节省了时间还避免了污染，此外，本专利技术实施例采用磁珠法对测序PCR产 物进行纯化，与传统的乙醇/醋酸钠法相比操作简单快捷、对设备要求简单（只需一个磁力 架）、纯化结果稳定，得到的测序峰图干净清晰、无染料峰。 【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。 图1是本专利技术实施例四提供的TOGFRA基因第12号外显子V561D突变型的测序峰 图； 图2是本专利技术实施例四提供的TOGFRA基因第18号外显子D842V突变型的测序峰 图； 图3是本专利技术实施例四提供的加入了锁核酸探针后检测TOGFRA基因18号外显子 的测序峰图； 图4是本专利技术实施例四提供的未加入锁核酸探针后检测TOGFRA基因18号外显子 的测序峰图； 图5是本专利技术实施例四提供的扩增曲线图。 【具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针，其特征在于，所述用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测所述PDGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、以及用于检测所述PDGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；PDGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；PDGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。

【技术特征摘要】
1. 一种用于检测H)GFRA基因突变的引物和探针，其特征在于，所述用于检测TOGFRA基 因突变的引物和探针包括用于检测所述TOGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、以及 用于检测所述TOGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正 向引物和反向引物，其中， PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； PDGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 4所示； PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 5所示； PDGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO. 6所示； 所述探针的5'端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3'端均连接有BHQ淬灭基团。2. -种用于检测TOGFRA基因突变的锁核酸探针，其特征在于，所述锁核酸探针包括： TOGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO. 7 所示； TOGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO. 8 所示； 所述锁核酸探针的3'端均连接有P04基团。3. -种用于检测TOGFRA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要 求1所述的引物和探针。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：如权利要求2所述 的锁核酸探针。5. 根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳，李品，霍然，唐景峰，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42