一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法技术

本发明专利技术提出了一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法，其中试剂盒包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括核酸扩增反应液和酶混合液，所述核酸扩增反应液包括B19上游引物、下游引物和B19探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。本发明专利技术试剂盒为预混反应液，避免了反应液和酶混合时带来的误差，减少了操作难度，极大提高了检测灵敏度。极大提高了检测灵敏度。极大提高了检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及PCR检测
，尤其涉及一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]人细小病毒B19是已知的最小的病毒，为单链线状DNA病毒，属于细小病毒科，无包膜，3500碱基组成的单链dna病毒，属微小病毒科，是红细胞病毒属的一种，直径20～25nm，对外界理化因素的抵抗力非常强。B19病毒可以被分为1、2、3三种基因型，其中1型和3型又各自分为两种亚型。
[0003]检测人细小病毒B19感染的常用方法依赖于抗原、抗体和核酸检测。B19病毒抗体的检测存在2～4周时间等待抗体产生的“窗口期”，抗原检测则灵敏度偏低，而核酸检测针对B19病毒的DNA，不受检测时间限制，且灵敏度最高，能够检测到样品中微量B19病毒核酸的存在，在B19病毒的检测方法中具有很大优势。目前B19核酸检测方法主要有PCR检测技术和恒温检测技术，由于恒温检测技术存在诸多苛刻条件，因此，采用荧光探针PCR原理，针对B19病毒特异性区域设计相应的引物及探针。
[0004]目前，市面上用于B19的PCR检测试剂盒的荧光PCR反应液和酶混合液分开，如专利号为CN111270008A公开的试剂盒，由于酶混合液添加量通常较少，容易引起一定的实验误差，因此需要开发一种稳定性和准确性均较高的B19病毒检测试剂盒以及方法。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提出了一种稳定性和准确性均较高的检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括核酸扩增反应液和酶混合液，所述核酸扩增反应液包括B19上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，所述序列号SEQ ID NO:3的探针5'端标记FAM荧光发生基团，3'端标记ZENTM
‑
IBFQ的双淬灭基团。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，所述序列号SEQ ID NO:6的探针5'端标记ROX荧光发生基团，3'端标记MGB。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，所述序列号为SEQ ID NO:1
‑
6的引物和探针的浓度均为10
‑
15umol/L。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53而设计
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶混合液包括Taq聚合酶和UNG酶。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述Taq聚合酶的浓度为3
‑
5U/μL，UNG酶的浓度为1
‑
3U/μL。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，所述核酸扩增反应液还包括Buffer缓冲液、dNTPs、ROX、TMAC、PEG2000、海藻糖和明胶。
[0014]在以上技术方案的基础上，优选的，所述Buffer缓冲液的浓度为5
×
Buffer缓冲液，dNTPs的浓度为1
‑
3mmol/L，ROX的含量为25μL，TMAC的浓度为20
‑
30mmol/L、PEG2000的质量分数为3
‑
5％、海藻糖的质量分数为1
‑
3％、明胶的质量分数为0.01
‑
0.05％。
[0015]第二方面，本专利技术提供了一种用于以非诊断目的检测人细小病毒B19的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
[0016]S1，提取待测样本的核酸；
[0017]S2，使用上述试剂盒对S1获得的核酸进行荧光PCR反应；
[0018]S3，获得并分析结果。
[0019]在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S1中，样本为血液。
[0020]本专利技术的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0021](1)本专利技术试剂盒为预混反应液，避免了反应液和酶混合时带来的误差，减少了操作难度，极大提高了检测灵敏度，同时缩短了操作时间。
[0022](2)本专利技术利用B19探针ZEN双淬灭探针含有一个5'端荧光基团，一个3'端IBFQ淬灭基团，以及专有的内置ZEN淬灭基团，使得本专利技术具有双重保障，除了在探针3'端具有普通淬灭基团外，其内部还添加有第二个淬灭基团，可降低本底信号，提高信噪比，降低多通道检测中荧光信号的相互串扰，还可增强双链结构的稳定性，阻止核酸外切酶的酶切作用。
[0023](3)内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，内标3
’
端加入一个能插入DNA小沟的小沟结合物(MGB)，可以大大提高探针的Tm值，增加杂交反应的特异性，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为本专利技术试剂盒的灵敏度验证结果图；
[0026]图2为本专利技术试剂盒利用标准品制作的B19的标准曲线图；
[0027]图3为本专利技术试剂盒稳定性检测验图(0天)；
[0028]图4为本专利技术试剂盒稳定性检测验图(7天)。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有
其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0031]实施例一
[0032]1、引物序列设计
[0033]针对B19病毒特异性区域设计的相应引物及探针如下：
[0034]上游引物：5'
‑
CCAAGAAACCCCGCATTACC
‑
3'，如SEQ ID NO:1所示；
[0035]下游引物：5'
‑
GCTAGCCTTAGTTCCCTTCCCAT
‑
3'，如SEQ ID NO:2所示；
[0036]探针：5'
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括核酸扩增反应液和酶混合液，所述核酸扩增反应液包括B19上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。2.如权利要求1所述的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：所述序列号SEQ ID NO:3的探针5'端标记FAM荧光发生基团，3'端标记ZENTM
‑
IBFQ双淬灭基团。3.如权利要求1所述的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：所述序列号SEQ ID NO:6的探针5'端标记ROX荧光发生基团，3'端标记MGB。4.如权利要求1所述的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：所述序列号为SEQ ID NO:1
‑
6的引物和探针的浓度均为10
‑
15umol/L。5.如权利要求1所述的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：所述内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53而设计。6.如权利要求1所述的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：所述酶混合液包括Taq聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，鄙孝威，尹璐，王秀娟，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：